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要培養(yǎng)蛋白質(zhì)單晶，必須在蛋白質(zhì)溶液，添加鹽類和沈淀劑，調(diào)整pH值和溫度，再將部份水分蒸發(fā)，使蛋白質(zhì)溶液達(dá)過飽和，緩慢沈積，產(chǎn)生晶核（nucleation），慢慢長成夠大的單晶。X光源的強(qiáng)弱限制單晶的大?。簩?duì)同步輻射光源而言，0.1 mm的單晶就夠作X光繞射實(shí)驗(yàn)；轉(zhuǎn)靶式X光則用0.3 mm以上的單晶尺寸;封管式的X光得用0.4 mm以上的單晶較合適。有時(shí)候單晶含重原子也可犧牲尺寸。以上所列的尺寸只供較佳范圍的參考，特例不能*排除。
（1）大量養(yǎng)晶法（bulk crystallization）：若急著養(yǎng)出單晶，則將純化之蛋白質(zhì)溶液加入固體鹽類或飽和鹽液，直到溶液中出現(xiàn)乳白混濁色，離心后把上清液（suppernatant）放置數(shù)天至數(shù)周，有可能養(yǎng)出單晶。
（2）批次養(yǎng)晶法（batch method）:若發(fā)現(xiàn)加入蛋白質(zhì)的沉淀劑和鹽類等化學(xué)藥品，在濃度C1產(chǎn)生沉淀，濃度Cn為液體，則在C1至Cn之間細(xì)分成一串濃度C1>C2>C3>….>Ci>Cn，（n-2）個(gè)小試管進(jìn)行養(yǎng)晶，可能結(jié)出單晶。此法之主要缺點(diǎn)在于蛋白質(zhì)的消耗量大。
（3）大量透析法（bulk dialysis）：把蛋白質(zhì)溶液包在半透膜（membrane）內(nèi)，浸入盛有化學(xué)藥品的器皿中，半透膜能讓小分子進(jìn)出，卻不會(huì)讓蛋白質(zhì)等大分子通過，則器皿中沉淀劑、鹽類和有機(jī)溶液等化學(xué)藥品會(huì)穿過半透膜，與蛋白質(zhì)起作用，直到膜之內(nèi)外的濃度梯度（concentration gradient）降到零為止。此法的好處在于，器皿中化學(xué)藥品之濃度可作連續(xù)之調(diào)整，pH值的范圍也可探討。壞處是膜之內(nèi)外濃度差異減少時(shí)，平衡速率也隨之降低。
（4）微量透析法（microdialysis）:把半透膜的體積縮小，綁在比鈕扣略大的襯架上，架體之凹槽內(nèi)注入蛋白質(zhì)溶液，包覆半透膜的體架放入盛有化學(xué)藥品的器皿，其養(yǎng)晶原理與大量透析法相同，只是使用蛋白質(zhì)和化學(xué)藥品的量放得少。注意凹槽內(nèi)不得留有氣泡，否則膜外的化學(xué)藥品為氣泡所阻止而無法透過氣泡，滲入膜內(nèi)的蛋白質(zhì)溶液。
（5）連續(xù)萃?。╯equential extraction）：此法所根據(jù)的原理是亞可比（Jacoby）的實(shí)驗(yàn)，他發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在硫酸銨溶液中溶解度隨溫度的提升而下降。在4℃以下取得上清液（supernatant），放在室溫長晶。先將蛋白質(zhì)溶液加入固體硫酸銨或飽和硫酸銨液體，使蛋白質(zhì)溶液沉淀，離心除去上清液。接著保持4℃以下處理一系列的蛋白質(zhì)沉淀物。準(zhǔn)備數(shù)種依次遞降濃度的沉淀劑（通常為蒸餾水），濃度高的沉淀劑先加入上述蛋白質(zhì)沉淀物中，以玻棒攪拌并離心，取出上清液，放在室溫養(yǎng)晶，再把濃度次高的沉淀劑加入上次未*溶解的蛋白質(zhì)沉淀物，攪拌離心，把上清液置于室溫養(yǎng)晶，依次類推，直到蛋白質(zhì)全部溶解為止。這樣每次取出的蛋白質(zhì)濃度依次遞減，溶液由低溫移至高溫，符合亞可比的準(zhǔn)則，可能養(yǎng)出蛋白質(zhì)單晶。
（6）自由接口間的擴(kuò)散法（free interface diffusion）：若蛋白質(zhì)在不同的溶劑中具有不同的溶解度，則蛋白質(zhì)注入盛有沉淀劑試管的上方或下方（依密度而定，密度大者放在下方），在兩種溶液的交界面擴(kuò)散會(huì)有晶核長出，裝置如圖7-10所示。
（7）凹盤或玻片上的蒸汽擴(kuò)散法（vapor diffusion on plates or slides）—座滴法：蛋白質(zhì)養(yǎng)晶的要領(lǐng)在于蛋白質(zhì)達(dá)成過飽和溶液，同時(shí)添加的化學(xué)藥物與蛋白質(zhì)起作用，協(xié)助晶核的形成。摻有化學(xué)藥品的蛋白質(zhì)溶液，其水分慢慢擴(kuò)散，達(dá)到過飽和溶液則有可能長出單晶。若蛋白質(zhì)溶液暴露在空氣中，水分蒸發(fā)掉，則蛋白質(zhì)干涸，無法形成單晶，原因是蛋白質(zhì)單晶約略維持液態(tài)的結(jié)構(gòu)，含有大量水分，水分與蛋白質(zhì)間形成許多氫鍵，水分蒸發(fā)，蛋白質(zhì)也無以為系，因此必須保持水分，使蛋白質(zhì)溶液密閉在一個(gè)容器中。同時(shí)還得調(diào)節(jié)水分，所以必須置放兩種溶液，使蛋白質(zhì)溶液中的水分?jǐn)U散到另一種高濃度的溶液中，以達(dá)蛋白質(zhì)溶液的過飽和。通常選擇適當(dāng)?shù)柠}類和有機(jī)溶劑，調(diào)在等電點(diǎn)的pH值，形成沉淀劑，把粉晶蛋白質(zhì)泡成一定濃度，約在5～40mg/ml之間，在凹盤的下凹孔鍍硅，注入一些蛋白質(zhì)溶液和沉淀劑總共10～40 m l。在凹盤外方的塑料盒，倒入20～30ml的沉淀劑。在塑料的四周涂真空油膏（Vacuum grease），加以密封。通常這樣的塑料盒對(duì)于每種養(yǎng)晶條件制備兩盒，一盒放在4℃的低溫，另盒放在室溫，待其長晶，快則一周，慢則數(shù)月，幸運(yùn)的話，可望長出單晶。通常一次制備數(shù)拾條件，大量養(yǎng)晶。要鑒定長出的單晶確實(shí)是蛋白質(zhì)而不是滴入的沉淀劑等化學(xué)藥品。若養(yǎng)出蛋白質(zhì)單晶太小，不足以供X光繞射實(shí)驗(yàn)使用，則可使用連續(xù)播種法把小晶粒養(yǎng)大：依照養(yǎng)出蛋白質(zhì)小單晶的條件，炮制母液（蛋白質(zhì)溶液配合沉淀劑），注入凹孔，外圍倒注沉淀劑，加以密封，等待約半天后，打開封蓋，把以前所養(yǎng)的小晶粒稍加清洗后放入，企圖長大，若長出的晶體仍然不符X光使用，則把zui后一次的晶體當(dāng)新晶種，再繼續(xù)播種，直到晶體夠大。此種養(yǎng)晶法的好處是：用量少，篩選多種條件相當(dāng)理想;易于修飾塑料盒內(nèi)沉淀劑的濃度。此種養(yǎng)晶法裝置，也可用具有凹槽的玻片來取代，在其一凹孔注入10m l的母液，另一凹孔注入20～40m l的沉淀劑，以小玻片密封，等待長晶。
（8）懸滴液蒸汽擴(kuò)散法（vapor diffusion in hanging drops）—懸滴法: 它在原理上和座滴法相同，皆以蒸汽達(dá)到平衡，利用少量蛋白質(zhì)篩選多種養(yǎng)晶條件。此法用量比座滴液更少。在方形或圓形的玻片上鍍硅，滴入少于10m l的蛋白質(zhì)母液，在培養(yǎng)皿的每一凹槽中注入1 ml的沉淀劑，把方形玻片翻轉(zhuǎn)，蓋在凹槽孔緣，加以密封，形成懸滴液，進(jìn)行擴(kuò)散，蛋白質(zhì)溶液達(dá)到過飽和，長出單晶。
（9）液體橋連法（liquid bridge）如圖7-12（b）所示，一小滴母液和一滴沉淀液分別滴在玻璃片的兩靠近處，以細(xì)針引導(dǎo)細(xì)橋相接，把此載有液滴的玻片放在密封容器中，在細(xì)橋相連處可望長出單晶。（10）濃度透析法（concentration dialysis）：，離子強(qiáng)度弱，則蛋白質(zhì)溶解度低，易形成晶核，長出單晶，可利用氮?dú)庠谘b有蛋白質(zhì)和鹽類的透析袋內(nèi)施壓，使鹽類穿透透析膜流出，降低袋內(nèi)鹽類濃度，使蛋白質(zhì)溶液在低離子強(qiáng)度下長出單晶。
（11）pH引導(dǎo)長晶法（crystallization induced by pH）：蛋白質(zhì)的溶解度在等電點(diǎn)的pH值zui低，是個(gè)良好的養(yǎng)晶條件。有些蛋白質(zhì)在不同的數(shù)個(gè)pH值，具有數(shù)個(gè)溶解度的極小，這些溶解度極小處可望長晶。利用透析法改變透析膜外的pH值是個(gè)好辦法。也可在蒸汽擴(kuò)散法中，在外圍滴入揮發(fā)性酸或堿（如氨水或干冰等）來調(diào)節(jié)pH值。
（12）溫度長晶法（temperature crystallization）：蛋白質(zhì)溶解度為溫度的函數(shù)，有些溶解度非常溫度敏感。通常溫度降低，分子排列較有秩序，引起能趨疲（熵）（entropy）的降低。由液體轉(zhuǎn)變到固體，其熵會(huì)降低，反之亦然。井然有序排列的分子易于長晶。通常一種長晶條件泡兩份，一份置于室溫，另一份放在4℃的冰箱。
（13）蒸發(fā)（evaporation）：這是zui原始的方法，為小分子的長晶常用法，也是某些蛋白質(zhì)常用的養(yǎng)晶法。在蛋白質(zhì)不變性的條件下，慢慢讓母液蒸發(fā)，使蛋白質(zhì)溶液達(dá)到過飽和，結(jié)出單晶。
（14）填加有效分子法（effector addition）：與有效分子（effector）結(jié)合的蛋白質(zhì)，其溶解度往往與無有效分子結(jié)合者差異大，可達(dá)到某些構(gòu)象（conformation）平衡狀態(tài)的存在，養(yǎng)出此種構(gòu)象單晶，通常的有效分子有配位體（ligand）和基質(zhì)（substrate）等。
（15）對(duì)蒸餾水透析法（dialysis against water）：離子強(qiáng)度弱則蛋白質(zhì)溶解度低，以半透膜裝母液，外浸蒸餾水，鹽類往膜外透出，待膜內(nèi)蛋白質(zhì)溶解度降低，可望長出單晶。此法相當(dāng)有效，值得嘗試。前提是蛋白質(zhì)不得變性（denature），有時(shí)添加少許 [0.02%（w/v）] 的 Sodium azide，或數(shù)滴甲苯（toluene）或氯仿（chloroform）有助防止細(xì)菌的滋長。
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（1）大量養(yǎng)晶法（bulk crystallization）：若急著養(yǎng)出單晶，則將純化之蛋白質(zhì)溶液加入固體鹽類或飽和鹽液，直到溶液中出現(xiàn)乳白混濁色，離心后把上清液（suppernatant）放置數(shù)天至數(shù)周，有可能養(yǎng)出單晶。
（2）批次養(yǎng)晶法（batch method）:若發(fā)現(xiàn)加入蛋白質(zhì)的沉淀劑和鹽類等化學(xué)藥品，在濃度C1產(chǎn)生沉淀，濃度Cn為液體，則在C1至Cn之間細(xì)分成一串濃度C1>C2>C3>….>Ci>Cn，（n-2）個(gè)小試管進(jìn)行養(yǎng)晶，可能結(jié)出單晶。此法之主要缺點(diǎn)在于蛋白質(zhì)的消耗量大。
（3）大量透析法（bulk dialysis）：把蛋白質(zhì)溶液包在半透膜（membrane）內(nèi)，浸入盛有化學(xué)藥品的器皿中，半透膜能讓小分子進(jìn)出，卻不會(huì)讓蛋白質(zhì)等大分子通過，則器皿中沉淀劑、鹽類和有機(jī)溶液等化學(xué)藥品會(huì)穿過半透膜，與蛋白質(zhì)起作用，直到膜之內(nèi)外的濃度梯度（concentration gradient）降到零為止。此法的好處在于，器皿中化學(xué)藥品之濃度可作連續(xù)之調(diào)整，pH值的范圍也可探討。壞處是膜之內(nèi)外濃度差異減少時(shí)，平衡速率也隨之降低。
（4）微量透析法（microdialysis）:把半透膜的體積縮小，綁在比鈕扣略大的襯架上，架體之凹槽內(nèi)注入蛋白質(zhì)溶液，包覆半透膜的體架放入盛有化學(xué)藥品的器皿，其養(yǎng)晶原理與大量透析法相同，只是使用蛋白質(zhì)和化學(xué)藥品的量放得少。注意凹槽內(nèi)不得留有氣泡，否則膜外的化學(xué)藥品為氣泡所阻止而無法透過氣泡，滲入膜內(nèi)的蛋白質(zhì)溶液。
（5）連續(xù)萃?。╯equential extraction）：此法所根據(jù)的原理是亞可比（Jacoby）的實(shí)驗(yàn)，他發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在硫酸銨溶液中溶解度隨溫度的提升而下降。在4℃以下取得上清液（supernatant），放在室溫長晶。先將蛋白質(zhì)溶液加入固體硫酸銨或飽和硫酸銨液體，使蛋白質(zhì)溶液沉淀，離心除去上清液。接著保持4℃以下處理一系列的蛋白質(zhì)沉淀物。準(zhǔn)備數(shù)種依次遞降濃度的沉淀劑（通常為蒸餾水），濃度高的沉淀劑先加入上述蛋白質(zhì)沉淀物中，以玻棒攪拌并離心，取出上清液，放在室溫養(yǎng)晶，再把濃度次高的沉淀劑加入上次未*溶解的蛋白質(zhì)沉淀物，攪拌離心，把上清液置于室溫養(yǎng)晶，依次類推，直到蛋白質(zhì)全部溶解為止。這樣每次取出的蛋白質(zhì)濃度依次遞減，溶液由低溫移至高溫，符合亞可比的準(zhǔn)則，可能養(yǎng)出蛋白質(zhì)單晶。
（6）自由接口間的擴(kuò)散法（free interface diffusion）：若蛋白質(zhì)在不同的溶劑中具有不同的溶解度，則蛋白質(zhì)注入盛有沉淀劑試管的上方或下方（依密度而定，密度大者放在下方），在兩種溶液的交界面擴(kuò)散會(huì)有晶核長出，裝置如圖7-10所示。
（7）凹盤或玻片上的蒸汽擴(kuò)散法（vapor diffusion on plates or slides）—座滴法：蛋白質(zhì)養(yǎng)晶的要領(lǐng)在于蛋白質(zhì)達(dá)成過飽和溶液，同時(shí)添加的化學(xué)藥物與蛋白質(zhì)起作用，協(xié)助晶核的形成。摻有化學(xué)藥品的蛋白質(zhì)溶液，其水分慢慢擴(kuò)散，達(dá)到過飽和溶液則有可能長出單晶。若蛋白質(zhì)溶液暴露在空氣中，水分蒸發(fā)掉，則蛋白質(zhì)干涸，無法形成單晶，原因是蛋白質(zhì)單晶約略維持液態(tài)的結(jié)構(gòu)，含有大量水分，水分與蛋白質(zhì)間形成許多氫鍵，水分蒸發(fā)，蛋白質(zhì)也無以為系，因此必須保持水分，使蛋白質(zhì)溶液密閉在一個(gè)容器中。同時(shí)還得調(diào)節(jié)水分，所以必須置放兩種溶液，使蛋白質(zhì)溶液中的水分?jǐn)U散到另一種高濃度的溶液中，以達(dá)蛋白質(zhì)溶液的過飽和。通常選擇適當(dāng)?shù)柠}類和有機(jī)溶劑，調(diào)在等電點(diǎn)的pH值，形成沉淀劑，把粉晶蛋白質(zhì)泡成一定濃度，約在5～40mg/ml之間，在凹盤的下凹孔鍍硅，注入一些蛋白質(zhì)溶液和沉淀劑總共10～40 m l。在凹盤外方的塑料盒，倒入20～30ml的沉淀劑。在塑料的四周涂真空油膏（Vacuum grease），加以密封。通常這樣的塑料盒對(duì)于每種養(yǎng)晶條件制備兩盒，一盒放在4℃的低溫，另盒放在室溫，待其長晶，快則一周，慢則數(shù)月，幸運(yùn)的話，可望長出單晶。通常一次制備數(shù)拾條件，大量養(yǎng)晶。要鑒定長出的單晶確實(shí)是蛋白質(zhì)而不是滴入的沉淀劑等化學(xué)藥品。若養(yǎng)出蛋白質(zhì)單晶太小，不足以供X光繞射實(shí)驗(yàn)使用，則可使用連續(xù)播種法把小晶粒養(yǎng)大：依照養(yǎng)出蛋白質(zhì)小單晶的條件，炮制母液（蛋白質(zhì)溶液配合沉淀劑），注入凹孔，外圍倒注沉淀劑，加以密封，等待約半天后，打開封蓋，把以前所養(yǎng)的小晶粒稍加清洗后放入，企圖長大，若長出的晶體仍然不符X光使用，則把zui后一次的晶體當(dāng)新晶種，再繼續(xù)播種，直到晶體夠大。此種養(yǎng)晶法的好處是：用量少，篩選多種條件相當(dāng)理想;易于修飾塑料盒內(nèi)沉淀劑的濃度。此種養(yǎng)晶法裝置，也可用具有凹槽的玻片來取代，在其一凹孔注入10m l的母液，另一凹孔注入20～40m l的沉淀劑，以小玻片密封，等待長晶。
（8）懸滴液蒸汽擴(kuò)散法（vapor diffusion in hanging drops）—懸滴法: 它在原理上和座滴法相同，皆以蒸汽達(dá)到平衡，利用少量蛋白質(zhì)篩選多種養(yǎng)晶條件。此法用量比座滴液更少。在方形或圓形的玻片上鍍硅，滴入少于10m l的蛋白質(zhì)母液，在培養(yǎng)皿的每一凹槽中注入1 ml的沉淀劑，把方形玻片翻轉(zhuǎn)，蓋在凹槽孔緣，加以密封，形成懸滴液，進(jìn)行擴(kuò)散，蛋白質(zhì)溶液達(dá)到過飽和，長出單晶。
（9）液體橋連法（liquid bridge）如圖7-12（b）所示，一小滴母液和一滴沉淀液分別滴在玻璃片的兩靠近處，以細(xì)針引導(dǎo)細(xì)橋相接，把此載有液滴的玻片放在密封容器中，在細(xì)橋相連處可望長出單晶。（10）濃度透析法（concentration dialysis）：，離子強(qiáng)度弱，則蛋白質(zhì)溶解度低，易形成晶核，長出單晶，可利用氮?dú)庠谘b有蛋白質(zhì)和鹽類的透析袋內(nèi)施壓，使鹽類穿透透析膜流出，降低袋內(nèi)鹽類濃度，使蛋白質(zhì)溶液在低離子強(qiáng)度下長出單晶。
（11）pH引導(dǎo)長晶法（crystallization induced by pH）：蛋白質(zhì)的溶解度在等電點(diǎn)的pH值zui低，是個(gè)良好的養(yǎng)晶條件。有些蛋白質(zhì)在不同的數(shù)個(gè)pH值，具有數(shù)個(gè)溶解度的極小，這些溶解度極小處可望長晶。利用透析法改變透析膜外的pH值是個(gè)好辦法。也可在蒸汽擴(kuò)散法中，在外圍滴入揮發(fā)性酸或堿（如氨水或干冰等）來調(diào)節(jié)pH值。
（12）溫度長晶法（temperature crystallization）：蛋白質(zhì)溶解度為溫度的函數(shù)，有些溶解度非常溫度敏感。通常溫度降低，分子排列較有秩序，引起能趨疲（熵）（entropy）的降低。由液體轉(zhuǎn)變到固體，其熵會(huì)降低，反之亦然。井然有序排列的分子易于長晶。通常一種長晶條件泡兩份，一份置于室溫，另一份放在4℃的冰箱。
（13）蒸發(fā)（evaporation）：這是zui原始的方法，為小分子的長晶常用法，也是某些蛋白質(zhì)常用的養(yǎng)晶法。在蛋白質(zhì)不變性的條件下，慢慢讓母液蒸發(fā)，使蛋白質(zhì)溶液達(dá)到過飽和，結(jié)出單晶。
（14）填加有效分子法（effector addition）：與有效分子（effector）結(jié)合的蛋白質(zhì)，其溶解度往往與無有效分子結(jié)合者差異大，可達(dá)到某些構(gòu)象（conformation）平衡狀態(tài)的存在，養(yǎng)出此種構(gòu)象單晶，通常的有效分子有配位體（ligand）和基質(zhì)（substrate）等。
（15）對(duì)蒸餾水透析法（dialysis against water）：離子強(qiáng)度弱則蛋白質(zhì)溶解度低，以半透膜裝母液，外浸蒸餾水，鹽類往膜外透出，待膜內(nèi)蛋白質(zhì)溶解度降低，可望長出單晶。此法相當(dāng)有效，值得嘗試。前提是蛋白質(zhì)不得變性（denature），有時(shí)添加少許 [0.02%（w/v）] 的 Sodium azide，或數(shù)滴甲苯（toluene）或氯仿（chloroform）有助防止細(xì)菌的滋長。
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