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影響ELISA試驗(yàn)效果常見問題原因分析及解決辦法

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ELISA試驗(yàn)以靈敏度較高、特異性較好的特點(diǎn)在科研上得到了廣泛的應(yīng)用，但操作中的各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)試驗(yàn)的檢測(cè)效果影響較大，如不注意，有可能導(dǎo)致顯色不全、花板等結(jié)果。 
下面將操作中各個(gè)環(huán)節(jié)常出現(xiàn)問題的原因及解決辦法總結(jié)于下： 
操作步驟： 


目錄
[隱藏]
1 選擇試劑： 
2 標(biāo)本收集與保存： 
3 試劑使用中的準(zhǔn)備工作及注意事項(xiàng)： 
4 加 樣： 
5 溫 育： 
6 洗 板： 
7 顯 色： 
8 終 止： 
9 讀 板： 
10 全過程： 
11 ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果判斷和數(shù)據(jù)分析


選擇試劑： 
選擇質(zhì)量?jī)?yōu)良的檢測(cè)試劑，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作，操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。 
參考準(zhǔn)備ELISA實(shí)驗(yàn)的正確步驟#ELISA實(shí)驗(yàn)的事前準(zhǔn)備工作一 
標(biāo)本收集與保存： 
避免使用肉眼可見的溶血標(biāo)本、高脂標(biāo)本和混濁標(biāo)本； 
2-8℃下，標(biāo)本可放置24-48小時(shí)，長(zhǎng)期保存需放置-20℃下。 
請(qǐng)避免反復(fù)凍融。 
具體請(qǐng)參照： 
ELISA實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集與處理： 
ELISA實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的保存： 
試劑使用中的準(zhǔn)備工作及注意事項(xiàng)： 
試劑盒中會(huì)有提示，一般需要準(zhǔn)備的有： 
洗滌液；用前配制；有的試劑盒會(huì)標(biāo)明，配好的4度下一般可以放一個(gè)月；如果沒有標(biāo)明，盡量用新鮮的，不要多配制。 
顯色液（有A液和B液的），用前15分鐘配制； 
標(biāo)準(zhǔn)品：有的試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品是已經(jīng)配制好的，4度保存；有的是要現(xiàn)配制的；按照說明書操作； 
濃縮生物素結(jié)合的二抗和HRP：如果需要配制，試劑盒沒注明配好可以保存多久的話，盡量現(xiàn)配現(xiàn)用（用前15分鐘配制）； 
原則是： 
試劑盒上沒有指出配制物的儲(chǔ)藏方式的話，應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用；不要怕麻煩； 
還有，小瓶的管子開蓋前要離心，以免蓋子上粘連以後總量不夠。 
加 樣：
室溫溫育的試劑，特別是溫育時(shí)間比較短的實(shí)驗(yàn)操作的試劑，加樣對(duì)數(shù)據(jù)的影響比較大。特別要注意加樣問題。 
不好的操作原因： 
不會(huì)正確使用加樣器； 
血清或血漿標(biāo)本分離不好即進(jìn)行加樣； 
手工操作中，加樣板過多造成加樣後放入孵箱前等待時(shí)間過長(zhǎng)（特別是室內(nèi)溫度較高時(shí)）； 
加完標(biāo)本再加酶試劑時(shí)酶濺出孔外； 


解決辦法： 
熟悉加樣器的使用，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前用水來練習(xí)加樣的快速和準(zhǔn)確； 
試驗(yàn)前標(biāo)本需緩慢升溫至室溫，若標(biāo)本為血清，凍結(jié)血清融解後，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清後再檢測(cè)； 
加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出； 
加樣後及時(shí)放入孵箱； 
加酶試劑後用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)板表面輕拭吸干； 
如果采用AT或其他全自動(dòng)加樣，選擇FAME或其他後處理儀器加酶試劑； 
標(biāo)本較多時(shí)，請(qǐng)分批操作。每次加樣在兩到三分鐘內(nèi)完成。加標(biāo)本時(shí)三排一加。每次加完樣進(jìn)行計(jì)時(shí)； 

參考ELISA#加樣 
溫 育： 
不好的操作原因： 
溫育時(shí)未貼封片或加蓋，使標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗*； 
溫育時(shí)間人為延長(zhǎng)，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗*。 
解決辦法： 
貼封片或加蓋：為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜復(fù)蓋板孔，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。 
按說明步驟嚴(yán)格控制操作時(shí)間。 
建議采用空氣浴進(jìn)行溫育。 
參考ELISA實(shí)驗(yàn)操作中的溫育（incubation） 
洗 板： 
結(jié)果不好的可能原因 
采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉。 
采用半自動(dòng)洗板機(jī)洗板時(shí)，洗液量不足，導(dǎo)致洗板不*；洗板針堵塞，抽吸不*；洗板不暢，導(dǎo)致洗板效果差。 
反應(yīng)板過多造成洗板等待時(shí)間長(zhǎng)。 
在間接法中如本底較高。 


在ELISA 操作中，洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù)，操作時(shí)尤為注意： 
保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板後在吸水紙或毛巾（選擇干凈、無或少塵的吸水材料）上輕輕拍干（若使用易掉渣的紙，紙屑會(huì)留在板孔中，由于紙屑中含有氧化劑而造成高值陰性。）； 
注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應(yīng)按要求稀釋，所用的水電導(dǎo)率在1.5us/cm 之下，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解後配制。 
保證洗板浸泡時(shí)間為40 秒左右，孔內(nèi)液體被洗板機(jī)吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。 
合理安排，或多用幾臺(tái)洗板機(jī)。 
在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長(zhǎng)浸泡時(shí)間。 
參考ELISA#洗滌 
顯 色： 
結(jié)果不好的可能原因 
顯色劑配制後放置時(shí)間過長(zhǎng)或使用過期顯色劑； 
加顯色劑時(shí)濺出孔外造成液體回流。 
解決方法： 
顯色劑盡量在臨用前配制，堅(jiān)持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用； 
加樣時(shí)保持顯色劑不外流，且加樣量要準(zhǔn)確，順序不能顛倒。 
A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。 
可以參考ELISA#顯色和比色 
終 止： 
結(jié)果不好的可能原因： 
加終止液時(shí)產(chǎn)生較多氣泡，導(dǎo)致假陽性增加。 


解決方法： 
加終止液時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，及時(shí)終止顯色。 
讀 板： 
結(jié)果不好的可能原因： 
讀板時(shí)板底底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面。 
應(yīng)保證酶標(biāo)板清潔。 
此外酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)室溫宜在15~30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30 分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。 
全過程： 
整個(gè)操作過程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸; 
實(shí)現(xiàn)ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化，有效提高檢測(cè)質(zhì)量。 

嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)，的試劑，正確的操作和良好的儀器是保證ELISA必要條件。在實(shí)際操作中必須嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖黠L(fēng)檢測(cè)每一份標(biāo)本，才能保證試驗(yàn)效果。 

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