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細(xì)胞中的蛋白質(zhì)通過合成和降解等活動控制處于恒定狀態(tài)。為了使細(xì)胞更，減少不必要的蛋白質(zhì)負(fù)荷，細(xì)胞中的大多數(shù)蛋白質(zhì)都有一個(gè)明確定義的半衰期。細(xì)胞進(jìn)化到降解蛋白質(zhì)的另一個(gè)原因是，確保及時(shí)清除已經(jīng)完成工作的蛋白質(zhì)(如細(xì)胞周期蛋白)，避免由于某些蛋白質(zhì)的構(gòu)成作用而可能發(fā)生的不良影響(如放松管制在細(xì)胞周期蛋白的蛋白酶體降解會加速不受控制的癌細(xì)胞的擴(kuò)散)。今天上海勁馬將介紹一些常用的測量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法。
一、脈沖追蹤：
這是一種追蹤蛋白質(zhì)并估計(jì)其穩(wěn)定性的傳統(tǒng)方法，除了涉及到處理放射性，這種方法在測量蛋白質(zhì)半衰期時(shí)比其他藥理方法具有明顯的優(yōu)勢，在實(shí)驗(yàn)室中仍然經(jīng)常使用。它不僅能測量蛋白質(zhì)半衰期，而且如果你擅長放射自顯影和亞細(xì)胞分離，還可以追蹤蛋白質(zhì)并確定其亞細(xì)胞定位。
實(shí)驗(yàn)涉及在短時(shí)間內(nèi)用放射性前體標(biāo)記細(xì)胞(脈沖，通常是在培養(yǎng)基中添加放射性的甲硫氨酸和/或半胱氨酸)，然后在蛋白質(zhì)動力學(xué)過程中，在培養(yǎng)基中添加未標(biāo)記的前體，細(xì)胞被允許恢復(fù)。隨著帶有標(biāo)記前體的舊蛋白在細(xì)胞內(nèi)被降解，使用未標(biāo)記前體的新蛋白同時(shí)被合成。在不同的時(shí)間點(diǎn)免疫沉淀蛋白質(zhì)，用放射自顯影法測量樣品中的放射性。根據(jù)非放射性蛋白質(zhì)取代放射性蛋白質(zhì)的速度，可以確定任何蛋白質(zhì)的半衰期。這種方法的另一種非放射性變異是zui近流行的bleach-chase(漂白追蹤)，具體方法是目的蛋白與熒光團(tuán)融合，進(jìn)而通過短暫的光脈沖來漂白，漂白促使標(biāo)記蛋白分為了兩種亞群：熒光蛋白和非熒光蛋白，漂白后熒光恢復(fù)率與降解速率相關(guān)。
二、環(huán)己酰亞胺追蹤：
這是一種更簡單的方法來替代脈沖追蹤和避免放射性的使用。通常，這種方法通過添加環(huán)己酰亞胺來抑制蛋白質(zhì)的合成，然后評估目的蛋白隨時(shí)間的降解情況。環(huán)己酰亞胺是一種新的蛋白質(zhì)合成抑制劑，通過與60S核糖體單位的E -位點(diǎn)結(jié)合，抑制翻譯的延伸。而這反過來又會抑制蛋白質(zhì)的合成，使研究人員不必?fù)?dān)心正在進(jìn)行的蛋白質(zhì)合成的影響，就能跟蹤蛋白質(zhì)的降解情況。加入環(huán)己酰亞胺將蛋白質(zhì)合成排除在外，使研究人員能夠?qū)ｉT研究蛋白質(zhì)降解隨時(shí)間的變化。
三、降解途徑的藥理學(xué)抑制劑：
細(xì)胞內(nèi)有兩種主要降解途徑：蛋白酶體途徑和溶酶體途徑。有一些特定的藥理學(xué)抑制劑可用于評估這兩種途徑的降解。蛋白酶體途徑通過一系列酶將蛋白質(zhì)用泛素標(biāo)記，這種泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)zui終定向到細(xì)胞蛋白酶體復(fù)合物，并在此被降解。但在某些情況下，蛋白酶體降解可能獨(dú)立于泛素化而發(fā)生，在對可能的降解途徑的假設(shè)進(jìn)行測試時(shí)，這一點(diǎn)不能忽視。更復(fù)雜的是，泛素化可能也會在溶酶體降解途徑中發(fā)揮作用。溶酶體降解也被分為許多不同的類型，基于實(shí)際的降解細(xì)胞機(jī)制的細(xì)微差別(大自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬)。
為了評估目的蛋白是否通過蛋白酶體途徑降解，可以通過藥物抑制蛋白酶體復(fù)合物，并評估這種干預(yù)對目的蛋白表達(dá)的影響。研究人員通常使用蛋白酶體抑制劑如MG-132，Epoxomicin和硼替佐米，這些抑制劑與蛋白酶體復(fù)合物中特定的蛋白水解位點(diǎn)結(jié)合并阻止蛋白質(zhì)的降解。還有一種藥理學(xué)抑制劑和遺傳策略研究自噬降解，這是一個(gè)值得單獨(dú)討論的話題。用于研究這種降解方式的抑制劑如氯喹和BafimlmycinA1，通過中和溶酶體中的酸性pH值來發(fā)揮作用，而這是溶酶體蛋白酶作用的必需條件。然后建立相關(guān)的劑量和持續(xù)時(shí)間，同時(shí)檢查細(xì)胞的生存能力，以確保使用這些藥物治療細(xì)胞，但不會殺死細(xì)胞。
四、降解相關(guān)的翻譯后修飾：
確定了目的蛋白的降解路徑，就可以分析哪些標(biāo)簽(翻譯后修飾，PTM)是這個(gè)過程必須的。有許多類型的PTMs可以標(biāo)記蛋白質(zhì)降解，也有特定的降解基序(降解決定子)，靶向蛋白質(zhì)降解途徑。一些常見的降解決定子如D-boxes，PEST, and KEN boxes，可以幫助蛋白質(zhì)標(biāo)記，并通過各種機(jī)制促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解。一些降解決定子能使蛋白更易接近E3連接酶，E3連接酶可以將其帶到蛋白酶體復(fù)合物中。
在開始對蛋白質(zhì)進(jìn)行突變分析之前，檢查蛋白質(zhì)的一級氨基酸序列，以確定是否有任何特定的降解決定子。如果文獻(xiàn)中沒有降解相關(guān)PTMs的優(yōu)先級，有一些特定的數(shù)據(jù)庫可以快速檢查，如PhosphoSite (磷酸化和其他PTMs)和mUbiSiDa(泛素化)。
在縮小你認(rèn)為與降解相關(guān)的殘留物后，下一步是改變這些殘留物，并評估這些突變對目的蛋白穩(wěn)定性的影響。例如，在降解相關(guān)的位點(diǎn)上，一個(gè)賴氨酸突變?yōu)榫彼?，可以去除泛素連接所必需的epsilon氨基，并能穩(wěn)定蛋白質(zhì)。類似地，如果認(rèn)為磷酸化對降解是關(guān)鍵的，那么磷酸缺陷的(如絲氨酸到丙氨酸)和磷酸模擬突變(如絲氨酸到谷氨酸)可以改變目的蛋白的降解曲線。
五、分析蛋白質(zhì)的泛素化動力學(xué)：
蛋白酶體降解往往先于泛素化。檢測泛素化可以提供一個(gè)強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)，證實(shí)目的蛋白很有可能成為蛋白酶體的靶點(diǎn)。比如拉下目的蛋白，然后使用抗泛素蛋白抗體來評估其泛素化狀態(tài)。當(dāng)IP樣本被抗泛素抗體檢測時(shí)，你通常希望看到的是一個(gè)涂片或梯形條帶效應(yīng)。這是因?yàn)椴煌母咝揎椥问降牡鞍踪|(zhì)被識別，因?yàn)樗鼈冎鸩奖欢鄠€(gè)泛素分子標(biāo)記。在蛋白酶體阻滯后，檢測到的泛素涂片的強(qiáng)度可能會變深——表明多泛素化蛋白的積聚。泛素化蛋白是出了名的不穩(wěn)定，并且收集細(xì)胞的具體實(shí)驗(yàn)條件和時(shí)間必須經(jīng)過仔細(xì)的優(yōu)化，以防止在樣本準(zhǔn)備過程中泛素化的丟失。因?yàn)樵谠S多情況下，基于抗體的方法可能由于非特定的下拉。一種更好更清潔的方法是將目的蛋白標(biāo)記his標(biāo)簽，并利用鎳柱親和拉下，評估蛋白質(zhì)的泛素化。另一個(gè)好的控制方法是使用HA標(biāo)記的泛素質(zhì)粒，并在下拉之前將其與目的蛋白共轉(zhuǎn)染。去除這些質(zhì)粒中的一種或兩種，應(yīng)該減少或甚至消除泛素化。
