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上海勁馬生物長期供應(yīng)Elisa試劑盒、實(shí)驗(yàn)耗材、儀器、酶、細(xì)胞等生物化學(xué)試劑。價(jià)格實(shí)惠，質(zhì)量有保證。詳細(xì)價(jià)格請(qǐng)咨詢?cè)诰€人員。
一、目的
學(xué)習(xí)原代培養(yǎng)方法，從供體取得組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的培養(yǎng)。
二、概述
組織塊培養(yǎng)法是常用的、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。可以采用剪切法，即將組織塊剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶，組織小塊貼壁24h或更長時(shí)間后，細(xì)胞就從組織四周游出。但由于在反復(fù)剪切和接種過程中對(duì)組織塊的損傷，并不是每個(gè)小塊都能長出細(xì)胞。用于組織塊培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶可根據(jù)不同細(xì)胞生長的需要作適當(dāng)處理，如預(yù)先涂以膠原薄層，以利于上皮樣細(xì)胞等的生長。（本節(jié)以新生牛主動(dòng)脈平滑肌培養(yǎng)為例）
三、材料
（一） 儀器
1. 凈化工作臺(tái)
2. 恒溫水浴箱
3. 冰箱（4℃、-20℃）
4. 倒置相差顯微鏡
5. 培養(yǎng)箱
（二） 玻璃器皿
1. 培養(yǎng)皿（Φ100mm）
2. 吸管（彎頭）
3. 燒杯（500ml、200ml、10ml）
4. 廣口試劑瓶（500ml）
5. 玻璃瓶（250ml、100ml）
6. 培養(yǎng)瓶
7. 廢液缸
（三） 塑料器皿
1. 吸頭
2. 槍頭
3. 膠塞
4. EP管
（四） 其他物品
1. 微量加樣槍
2. 眼科組織剪（直尖、彎）
3. 眼科組織鑷（直、彎）
4. 12.5cm組織鑷（無鉤、1×2鉤）
5. 25cm敷料鑷（無鉤）
6. 止血鉗（18cm直紋式、12.5cm直紋式、彎紋式）
7. 解剖剪
（五） 試劑
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. RPMI1640
4. 雙抗（青霉素、鏈霉素）
5. 1N HCl
6. 7.4%NaHCO3
四、操作步驟
1. 取材：打開胸腔，無菌操作下取出主動(dòng)脈胸段，浸到預(yù)先配制好的含雙抗（500u/ml青、鏈酶素）的D-Hanks液中漂洗。
2. 組織的沖洗、修剪：取出主動(dòng)脈，用鋒利的剪刀修剪除去周圍組織，再用D-Hanks沖洗主動(dòng)脈3次，除去血塊及雜組織等。
3. 平滑肌組織分離：縱向剖開主動(dòng)脈，撕下主動(dòng)脈內(nèi)層，取主動(dòng)脈中層的平滑肌組織，無血清RPMI1640漂洗3次。
4. 剪切：將平滑肌組織用鋒利的眼科剪反復(fù)剪切至剪成1mm3小塊，在剪切過程中，可以適當(dāng)向組織中滴加1～2滴培養(yǎng)液，以保持濕潤。
5. 貼塊：將剪切好的組織小塊，用眼科鑷送入培養(yǎng)瓶內(nèi)，用彎頭吸管將組織塊均勻擺置，每小塊間距0.5cm左右，組織塊放置好后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓瓶底朝上，向瓶內(nèi)注入適量含10%牛血清培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋。
6. 培養(yǎng)：將培養(yǎng)瓶瓶底朝上，37℃培養(yǎng)箱放置2～4h，待組織小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)。
7. 換液：原代培養(yǎng)3～5d，需換液一次，去除漂浮的組織塊和殘留的血細(xì)胞。
組織塊培養(yǎng)法也可不用翻轉(zhuǎn)法，即在擺放組織塊后，向培養(yǎng)瓶內(nèi)僅加入少量培養(yǎng)液，以能保持組織塊濕潤即可，蓋好瓶蓋，放置37℃培養(yǎng)箱24h再補(bǔ)加培養(yǎng)液。
注意事項(xiàng)
1. 取材的組織盡快培養(yǎng)。因故不能即時(shí)培養(yǎng)，可將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果組織塊很大，應(yīng)切成1cm3以下的小塊再低溫保存，但時(shí)間不能超過24h。
2. 從消化道、周圍有壞死組織等污染因素存在的區(qū)域取材，可用含500～1000u/ml的青、鏈霉素BSS液漂洗5～10min，或用10%達(dá)克寧注射液沖洗浸泡10min再作培養(yǎng)。
3. 組織塊不易貼壁，可預(yù)先在瓶壁涂薄層血清、胎汁或鼠尾膠等。
4. 原代培養(yǎng)的1～2d內(nèi)要特別注意觀察是否有細(xì)菌、霉菌的污染，一旦發(fā)現(xiàn)，要及時(shí)清除。
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