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Western Blot
Western Blot即免疫印跡試驗(yàn)，可以利用Western Blot來(lái)比較在不同條件下，不同細(xì)胞組織中目的蛋白表達(dá)量的差異，屬于定性，半定量試驗(yàn)。既然有差異性比較，參照物*。Western Blot試驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)（表達(dá)量）參照物即內(nèi)參，有了參照物才能準(zhǔn)確地比較目的蛋白表達(dá)量的差異。內(nèi)參一般選用管家基因表達(dá)的蛋白，它們?cè)诟鱾€(gè)組織細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)恒定，不會(huì)因?yàn)橥獠織l件變化而引起表達(dá)量的變化。而且內(nèi)參可以監(jiān)測(cè)整個(gè)試驗(yàn)體系是否正常，比如蛋白提取過(guò)程，轉(zhuǎn)膜體系，顯色體系等。beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 等已作為成熟的內(nèi)參運(yùn)用到試驗(yàn)中，下面就大致介紹下如何選擇內(nèi)參：
樣本來(lái)源
1.哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞主要以 beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 為代表。
2.植物樣本主要以 actin、Rubisco 為代表。
目的蛋白定位
1.全細(xì)胞蛋白和細(xì)胞質(zhì)：beta Actin、beta Tubulin、GAPDH等
2.細(xì)胞核蛋白: PCNA等
3.核膜蛋白：Lamin B1等
4.胞膜蛋白：Na(+)/K(+) ATPase等
目的蛋白分子量
beta Actin、beta Tubulin、GAPDH 的分子量分別是 42kd，50kd，37kd，目的蛋白分子量能與內(nèi)參蛋白分子量相差 5kd 以上，才能分開(kāi)目的蛋白和內(nèi)參，寫(xiě)文章做圖也更美觀。
三大內(nèi)參
beta Actin，肌動(dòng)蛋白，細(xì)胞骨架蛋白。它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物。beta Actin 作為內(nèi)參是得到*的，針對(duì)大多數(shù)組織和細(xì)胞來(lái)說(shuō)的，它廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，表達(dá)量非常豐富。但是在一些少量特殊的情況下比如脂肪組織和細(xì)胞內(nèi)，beta Actin 的表達(dá)量就很少。
GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，該酶是糖酵解反應(yīng)中的一個(gè)酶，幾乎在所有組織細(xì)胞中都高水平表達(dá)，在同種細(xì)胞或組織中的表達(dá)量一般是恒定的，且很少受外部誘導(dǎo)物的影響。但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下，會(huì)增加 GAPDH 在特定細(xì)胞和組織中的表達(dá)。
beta Tubulin，微管蛋白，細(xì)胞骨架蛋白。作為內(nèi)參抗體，beta Tubulin 表達(dá)通常不會(huì)發(fā)生改變，因此被廣泛用于 Western Blot 內(nèi)參，也常被用于免疫染色觀察細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)。
下面是多年項(xiàng)目經(jīng)理在開(kāi)發(fā)抗體時(shí)的一點(diǎn)心得，希望對(duì)大家有幫助。
1.不同的內(nèi)參在選擇上也要根據(jù)具體的樣本情況選擇，沒(méi)有一種內(nèi)參能適用所有的組織和細(xì)胞樣本。比如，血紅細(xì)胞（因?yàn)槠浼?xì)胞結(jié)構(gòu)的特殊性和需要攜帶氧氣的功能性）樣本就不適合以上 3 種常用內(nèi)參。如果使用會(huì)導(dǎo)致結(jié)果很差或者沒(méi)有結(jié)果?？梢赃x用血紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)性蛋白作為內(nèi)參代替。
2.在做多組織多細(xì)胞樣本對(duì)比表達(dá)量時(shí)，選用 GAPDH 作為內(nèi)參，因?yàn)?GAPDH 是代謝類(lèi)蛋白，在活組織中表達(dá)比較恒定。而 beta Actin 和 beta Tubulin 是結(jié)構(gòu)蛋白，不同組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)會(huì)有差異性，如腦組織的 tubulin 的表達(dá)會(huì)高一些（因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞的軸突和樹(shù)突都由 tubulin 維持結(jié)構(gòu)），而 actin 的表達(dá)量可能會(huì)低一些。再比如，骨骼肌、心肌和平滑肌的特殊功能反而導(dǎo)致了 tubulin 的表達(dá)改變和特化。心肌的 beta Actin 的表達(dá)量可能變少，而 alpha Actin 表達(dá)量高。因?yàn)檫@些組織的差異，現(xiàn)在慢慢采用總 Actin 和總 tubulin 作為內(nèi)參，可以盡量減少一些組織表達(dá)量差異。
3.做各種分泌液樣本的時(shí)候，如血漿，乳汁，組織液等，以上的 3 種內(nèi)參也不是很合適。由于沒(méi)有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，所以只能選擇一些分泌蛋白作為內(nèi)參，或者采用其他方式作為內(nèi)參。
4.做誘導(dǎo)后樣本或檢測(cè)磷酸化等修飾性抗體時(shí)，選擇結(jié)構(gòu)蛋白作為內(nèi)參，如 beta Actin 和 beta Tubulin。因?yàn)?GAPDH 是代謝類(lèi)蛋白，表達(dá)量有可能會(huì)受到誘導(dǎo)處理的影響。同時(shí)，做修飾性抗體的 Western Blot 實(shí)驗(yàn)，也帶上同抗原的總抗作為陽(yáng)性對(duì)照。
5.做Western Blot實(shí)驗(yàn)時(shí)，內(nèi)參的條帶強(qiáng)度也要適當(dāng)控制。不要讓內(nèi)參條帶發(fā)生過(guò)度曝光的情況，尤其是用 X 膠片曝光的。如果內(nèi)參條帶過(guò)度曝光，條帶會(huì)顯得很寬，妨礙對(duì)條帶正確強(qiáng)度的判讀，進(jìn)而影響對(duì)其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。的內(nèi)參結(jié)果是：窄窄的，黑色實(shí)心條帶。
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