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免疫組織化學(xué)技術(shù)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，是指用標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)免疫檢測(cè)方法。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性和分子生物技術(shù)的敏感性等巧妙結(jié)合，借助顯微鏡的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等），是單一的靜止的形態(tài)學(xué)描述，上升到結(jié)構(gòu)、功能和代謝為一體的動(dòng)態(tài)觀察，為疾病的診斷、鑒別診斷和發(fā)病機(jī)制的研究提供了強(qiáng)有力的手段。
然而，要想得到一張高質(zhì)量的免疫組化染色切片也并非易事。由于切片制作和免疫組化染色過程均存在很多步驟或環(huán)節(jié)，每一個(gè)步驟或環(huán)節(jié)都需要操作者嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，否則可能會(huì)影響到zui終結(jié)果。現(xiàn)就試驗(yàn)中遇到得常見問題進(jìn)行分析總結(jié)，給進(jìn)一步給出解決方案，希望能為幫助相關(guān)實(shí)驗(yàn)人員提供實(shí)驗(yàn)成功率。
免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的常見問題及其解決方法：
| 出現(xiàn)的問題 | 可能的原因 | 處理方法 |
| 染色陰性 | 試劑失效 | 重新試驗(yàn)，設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照 |
| 漏加試劑 | ||
| 試劑加入順序顛倒 | ||
| 組織中無目的抗原表達(dá)或表達(dá)量太低 | 查閱文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù)，確定組織中確有目的蛋白強(qiáng)表達(dá)。設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照片，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 | |
| 一抗與二抗種屬不匹配 | 仔細(xì)確定一抗與二抗種屬無誤，如果一抗來源于兔，則二抗需選擇抗兔二抗，了解一抗的類型，如果一抗是小鼠IgG1，那么二抗應(yīng)選擇抗小鼠IgG1 | |
| 抗體不足 | 提供抗體量，延長(zhǎng)孵育時(shí)間，如4度反應(yīng)過夜 | |
| 組織未進(jìn)行抗原修復(fù) | 有些組織需要經(jīng)過抗原修復(fù)才能檢測(cè)抗原表達(dá) | |
| 在固定和包埋過程中，抗原變形導(dǎo)致表位變化 | 采用多種抗原恢復(fù)方法 | |
| 包埋時(shí)控制溫度在58度或低于58度 | ||
| 沖洗液與反應(yīng)試劑不匹配 | 調(diào)整溶液PH值，注意過氧化物酶底物匹配的溶液中不應(yīng)含有疊氮鈉 | |
| 染色弱 | 抗體濃度過低 | 提高抗體濃度，孵育時(shí)間不能少于60分鐘 |
| 抗體孵育時(shí)間過短 | 抗體孵育時(shí)間不能少于60分鐘 | |
| 標(biāo)本中目的蛋白表達(dá)量低 | 查閱文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù)，確定組織中確有目的蛋白強(qiáng)表達(dá)。設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照片，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 | |
| 操作中，切片遺留太多沖洗液，導(dǎo)致試劑稀釋 | 每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液（但防止切片干燥） | |
| 孵育時(shí)切片未放平，導(dǎo)致抗體流失 | 孵育時(shí)，注意切片應(yīng)水平放置 | |
| 蛋白封閉過度 | 封閉時(shí)間不要超過10分鐘 | |
| 不適當(dāng)?shù)臉?biāo)本固定方式 | 選擇合適的固定方法 | |
| 不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方式 | 延長(zhǎng)抗原修復(fù)時(shí)間，或者調(diào)整抗原修復(fù)體系，建議參照生產(chǎn)廠家的說明，同時(shí)結(jié)合標(biāo)本的具體情況來確定 | |
| 非特異性背景染色，全片著色 | 抗體濃度過高 | 降低抗體濃度 |
| 抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng) | 嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，建議使用定時(shí)器及時(shí)提醒，避免造成時(shí)間延長(zhǎng) | |
| 孵育溫度過高，孵育溫度超過37度 | 建議控制孵育溫度 |
