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上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司
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口蹄疫病毒 RT-PCR檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
用途
口蹄疫病毒( FMDV)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)( RT-PCR)，用于檢測(cè)疑似感染動(dòng)物的水皰皮或水皰液中所有血清型的 FMDV，適用于 FMDV的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
原理
利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取 RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以 RNA為模板，以引物為起點(diǎn)合成與 RNA模板互補(bǔ)的 cDNA鏈。在 TaqDNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)，使特異 DNA片段的拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過(guò) 35次循環(huán)，zui終使擴(kuò)增 DNA片段放大了數(shù)百萬(wàn)倍。將擴(kuò)增 DNA片段進(jìn)行電泳，經(jīng)染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見(jiàn)到 DNA片段的擴(kuò)增帶。
試劑
1．試劑盒組成
2．試劑盒保存期：6個(gè)月。
需要自備的器材
1．儀器：分析天平、離心機(jī)、 PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀(或紫外分析儀)、微波爐、組織研磨器、-20℃冰箱、可調(diào)移液器(2µL、20µL、200 µL、1000 µL)。
2．耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、 20mL一次性注射器、生理鹽水、瓊脂糖、 500mL量筒、500 mL錐形瓶、經(jīng)焦碳酸二乙酯( DEPC)水處理的滅菌 1.5mL離心管和吸頭( 10 µL、200µL、1000 µL)、滅菌雙蒸水。
使用注意事項(xiàng)
1．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處理，以免污染實(shí)驗(yàn)室。 2．PCR整個(gè)試驗(yàn)分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)
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模板提取區(qū)擴(kuò)增區(qū)
電泳區(qū)。嚴(yán)禁器材和試劑倒流。
1 所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存， -20℃保存的各試劑使用前應(yīng)放于室溫*融化，使用后立即放回 -20℃。
2 染色液低毒，應(yīng)于室溫條件避光保存，操作時(shí)應(yīng)戴上手套。
3 注意防止試劑盒組分受污染。使用前將紅蓋管 8000 rpm離心 15 s，使液體全部沉于管底，放于
冰盒中，吸取液體時(shí)移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。
1 不要使用超過(guò)有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
2 RNA提取過(guò)程中，避免 RNA酶污染，盡量縮短操作時(shí)間。
3 嚴(yán)格遵守操作說(shuō)明可以獲得的結(jié)果。操作過(guò)程中移液、定時(shí)等全部過(guò)程必須。
4 反復(fù)凍融試劑將減低檢測(cè)靈敏度，建議在 3次內(nèi)用完，請(qǐng)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
樣品制備
1樣品采集：病死或撲殺的偶蹄動(dòng)物，取潰爛或潰瘍的表皮組織等；待檢的活動(dòng)物，取水皰皮或水皰液置于 50%甘油生理鹽水中。2～8℃保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。(要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。) 2樣品處理：每份樣品分別處理。
1. 1組織樣品處理：每份組織分別從三個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.05 g于研磨器中研磨，加入 1.5 mL生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5 mL滅菌離心管中，8000rpm離心 2min，取上清液 100 µL于 1.5 mL滅菌離心管中。
2. 2水皰液處理：取 100 µL，置 1.5 mL滅菌離心管中。
3. 3陽(yáng)性對(duì)照處理：取陽(yáng)性對(duì)照 100µL，置 1.5mL滅菌離心管中。
4. 4陰性對(duì)照處理：取陰性對(duì)照 100µL，置 1.5mL滅菌離心管中。
操作步驟 1病毒 RNA的提取
1.1取已處理的樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，分別加入裂解液 600µL，充分顛倒混勻，室溫靜置 3～ 5min。
1.2將液體吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管，吸取液體時(shí)盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時(shí)堵塞吸附柱)，13000rpm離心 30s，棄去收集管中液體，套上收集管。
1.3向吸附柱中加入 600 µL洗液，13000 rpm離心 30 s，棄去收集管中液體，套上收集管。
1.4重復(fù)步驟 1.3。
1.5再空柱 13000rpm離心 2min。
1.6將吸附柱移入新的 1.5 mL離心管中，在膜中央加入洗脫液 25 µL，室溫靜置 1min，13000rpm離心 30 s，獲得總 RNA。 2RT-PCR操作程序
每份總體積 20 µL，含 16.8µLRT-PCR反應(yīng)液(用前混勻)，1.2 µL酶混合液，2µL模板 RNA。
例如：n份樣品(n<10)，配制 n+1份，16.8×(n+1)RT-PCR反應(yīng)液，再加入 1.2×(n+1)酶混合液混勻，取 18µL分裝成 n份，分別加入 2µL模板 RNA(陽(yáng)性對(duì)照管加入 1µL陽(yáng)性對(duì)照 RNA和 1µLX液)，加入礦物油 20 µL覆蓋(有熱蓋的 PCR擴(kuò)增儀不用加礦物油)，作好標(biāo)記。
在 PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下程序： 42 ℃ 45 min，95 ℃ 3min；擴(kuò)增條件為 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s， 35個(gè)循環(huán)； 60℃延伸 3min。 3電泳
稱 4g瓊脂糖放于 500mL錐形瓶中，加入 50倍稀釋的 TAE電泳緩沖液 200mL(取 4mL50倍 TAE電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至 200 mL)，于微波爐中熔解，再加入 10 µL染色液混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 10 µL混合 2µL上樣緩沖液，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以 110～120V電壓于 50倍稀釋的 TAE電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。
結(jié)果判定
陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn) 131 bp擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無(wú)帶出現(xiàn)(引物帶除外)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn) 131 bp擴(kuò)增帶為口蹄疫病毒陽(yáng)性，否則為陰性。
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