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（一）藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)的MTT法:
用培養(yǎng)基將腫瘤細(xì)胞調(diào)整至2 X108個/L,在96孔板中每孔加入100ul細(xì)胞懸液于37℃、5% CO2下培養(yǎng)過夜.
次日每孔加入不同濃度的藥物100mg/L作為試驗組,設(shè)加*培養(yǎng)基不加藥物的陰性對照,并用功能明確的藥物為陽性對照和0.5%的乙醇溶劑對照,每組均設(shè)4-6個復(fù)孔（平行孔）、37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng).
培養(yǎng)至12h、24h、48h、實驗終止前4-6h加入10ulMTT（5g/L）,培養(yǎng)4-6h后,陰性對照孔中已形成明顯的藍(lán)紫色顆粒結(jié)晶時加100ul/孔SDS-HCl終止反應(yīng),于37℃存放過夜.
用酶標(biāo)儀在A570波長下測吸光度值,按下式計算抑制率
抑制率（%）=（1-試驗組平均吸光度值/陰性對照組平均吸光度值） x 100%.
（二）熒光法:
選用上述*濃度作用于腫瘤細(xì)胞,培養(yǎng)細(xì)胞48h后,收貨細(xì)胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室溫下固定30min.
棄去固定液,并用PBS洗2次后,用1%Triton X-100作用4min加入適量的0.5mg/L DAPI熒光染色60min,用PBS沖洗3次,取10ul滴片,干燥后于熒光顯微鏡下檢測斷裂的顆粒和片狀熒光.
（三）DNA瓊脂糖凝膠電泳法:
1、DNA提取:
用大方瓶培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞,每瓶10ml,細(xì)胞濃度為3 x 108個/ml,每隔藥物濃度、作用時間均設(shè)2瓶,共分3個時間段,4個藥物濃度.共培養(yǎng)26瓶細(xì)胞.
分別于細(xì)胞中加入不同濃度的藥物,于37℃、5% CO2中分別培養(yǎng)12h、24h、48h,收貨細(xì)胞,用PBS洗2-3次.
于-20℃將細(xì)胞冷卻處理10min后將細(xì)胞收集至離心管中,加1ml細(xì)胞裂解液,再加蛋白酶K,輕輕振搖使懸液混勻,成黏糊狀,50℃過夜.
冷卻后加入等體積的飽和酚溶液,混合后10000r/min離心10min,吸出上層水相,移至另一離心管中,再加入等體積飽和酚溶液重復(fù)抽提一次,直到無蛋白為止.
吸上清加入氯仿/異戊醇（24:1）按上述方法再抽提一次.
吸取水相層加入1/10體積的3mol/L的醋酸鈉溶液,混勻.
再加入2.5倍體積冷無水乙醇,混合置-20℃處理30min后,10000r/min離心10min,沉淀部分為提供的DNA,棄去無水乙醇后用70%乙醇漂洗2次,將離心管倒扣在吸水紙上,吸干乙醇.
加入200ulTE緩沖液融解DNA,再加入25ul的RNA酶,置37℃作用30min,置4℃冰箱保存.
2、瓊脂糖凝膠電泳:
TBE緩沖液配制1.8%瓊脂糖凝膠.在微波爐內(nèi)煮沸至瓊脂糖融解,待冷卻至60℃時,加入溴化乙錠,使其終濃度為0.5mg/ml,混勻后灌膠.
待凝膠固定后放入含TBE電泳液的電泳槽內(nèi),使TBE電泳液蓋過凝膠.
取10-15ul提取的各組DNA樣品液與上樣緩沖液按4:1比例混勻后點樣.
60V電泳1h,用紫外透射儀觀察梯形條帶.
（四）透射電鏡形態(tài)學(xué)觀察法:
收集藥物作用后*凋亡時期的凋亡腫瘤細(xì)胞,細(xì)胞總量大于10^6個,用PBS洗2遍后用3%戊二醛固定1h,PBS洗2次,再用1%鋨酸固定1h,丙酮酸梯度脫水.
細(xì)胞用樹脂包埋,并進(jìn)行超薄切片,用醋酸鈉-枸櫞酸鉛染色,透射電鏡下觀察凋亡的細(xì)胞形態(tài),可見有染色質(zhì)濃集,不均勻分布,考核周邊形成有核膜包裹的斷裂核碎片,呈新月形凋亡小體,并選擇典型切片圖像攝影.
（五）流式細(xì)胞儀檢測法:
1、原理:
處于增殖周期中的細(xì)胞,根據(jù)其所處不同周期時相其DNA含量分布在2n-4n之間,發(fā)生凋亡的細(xì)胞內(nèi)與核內(nèi)DNA裂解成許多小片斷,用細(xì)胞膜通透法可使小分子量的DNA 片斷穿過薄膜而丟失,僅剩下大分子量DNA 片斷,這些失去部分DNA的細(xì)胞可形成一個DNA含量小于2n的分布區(qū),稱“亞G1峰”,即AO峰（凋亡峰）.
2.特點:
經(jīng)濟簡便,僅需單一染色.
可判斷凋亡細(xì)胞發(fā)生于哪一周期.
可定量測定凋亡率,結(jié)果客觀可信.
用同樣本可同時進(jìn)行“亞G1峰”測定及DNA凝膠電泳.
3、方法步驟:
收貨不同劑量藥物作用于各不同時期的腫瘤細(xì)胞,細(xì)胞總數(shù)應(yīng)大于10^6個,用PBS洗2次,加入70%酒精固定,4℃存放.
染色前用PBS離心沉淀去除固定液,并用PBS洗1-2次,加入200ul RNA酶,37℃水浴30min.
每毫升細(xì)胞懸液中加入碘化丙錠（PI）染液100ul混勻,置4℃避光30min,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析,低于G1期DNA含量的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞.測定“亞G1峰”值和細(xì)胞凋亡率.
除上述常用的方法外,還可采用
ELISA法.其凋亡的斷裂核可與抗組蛋白抗體及抗DNA抗體混合物反應(yīng)后形成雙抗體“夾心”結(jié)構(gòu),再經(jīng)酶顯色也可判斷.末端轉(zhuǎn)移的酶標(biāo)記技術(shù),利用核裂解碎片含有3/-OH的末端,在末端轉(zhuǎn)移酶作用下加入已標(biāo)記的核苷酸,在3/-OH末端上合成一段含標(biāo)記的尾巴,再經(jīng)酶顯色或用熒光抗體顯示出來.
