近日來自霍華德• 休斯醫(yī)學院Janelia Farm Research研究所的科學家們開發(fā)了一種新型顯微鏡技術，并利用這一技術中在單個活細胞中獲得了高分辨率的三維（3D）亞細胞影像。研究人員將這一新技術命名為“貝塞爾光束平面照明顯微鏡”（ Bessel beam plane illumination microscopy），這種顯微鏡將幫助研究人員比以往更深入地觀察活體中的生物進程。相關研究成果發(fā)表在3月4日的《自然方法學》（Nature methods）雜志上。

    這一研究小組的負責人是霍華德• 休斯醫(yī)學研究所的Eric Betzig教授。他從事高分辨顯微鏡技術的開發(fā)及研究工作已超過30年。“盡管在這30年里取得了飛速的發(fā)展，然而由于大量的顯微鏡技術都需要對將樣本進行切割和固定成像，因而獲得的只能是來自死細胞的靜態(tài)圖像，從而阻礙了顯微鏡技術應用到更廣泛的研究領域，”Eric Betzig說。

    早在2006年，Betzig就著手研究改良活細胞顯微鏡技術的新途徑。當時他將設計新顯微鏡技術的焦點放在了突破空間分辨率的限制上。在不久后，Betzig以及同事Harald Hess就開發(fā)出了一種光敏定位顯微鏡（PALM），PALM可以用來在10-20納米范圍內觀察生物圖像，相對于電子顯微鏡有更清晰的對比度。

    然而PALM與大多數其他顯微鏡一樣，其工作原理是通過物鏡投射光層使樣本曝光，然后再將光線重新積聚返回至同一物鏡中。這種方法中采用的光線有可能對樣品造成損傷，并導致生成的影像模糊，因而無法對活細胞進行觀察。

    2008年，Betzig便致力于攻克這些技術難題。他想到的一種方法就是利用平面照明顯微鏡技術。這一技術產生于100多年前，平面照明是指照射光線通過樣品的側面而非頂部。要達到這一效應，必須采用兩個相互垂直的物鏡。“平面照明可使光線接近于樣品的焦點區(qū)域，”Betzig說。

    盡管其他的研究人員包括Janelia Farm Research研究所的工作人員Philipp Keller利用平面照明在數百納米的范圍內獲得了多細胞生物體的影像。然而由于光層仍然太厚使得研究人員無法有效地在數十納米的范圍內對單細胞進行成像。利用平面照明獲得的大片的光線仍然存在影像模糊和光損傷等問題。為了攻克這一難題，Betzig研究小組利用了貝塞爾光束（Bessel beam）。貝塞爾光束是物理學家們在20世紀80年代末發(fā)現(xiàn)的一種特異的無衍射光束，現(xiàn)在被廣泛應用在超市的條形碼掃描儀中。研究人員證實利用這種光束掃描樣品可產生更薄的光層。

    此外，Betzig還采用了另一種稱為雙光子顯微鏡的策略，這種方法常用于神經科學研究中對腦組織進行分層成像。雙光子顯微鏡技術的主要優(yōu)勢之一在于可使微弱曝光的區(qū)域生成極少的熒光信號。因此當使用雙光子技術時，可在保留貝塞爾光束狹長中心光線的同時減少兩側的背景影像。

    基于這些策略研究人員成功地構建了貝塞爾光束平面照明顯微鏡。由于貝塞爾光束平面照明顯微鏡投射超薄的光層通過樣本，移動通過超薄光層的樣本形成每一層的圖像。貝塞爾光束平面照明顯微鏡不會模糊光線，因此使樣品的影像更為清晰銳利，而沒有通常的背景影像。觀察結束后，完成的樣品還可以繼續(xù)存活生長。貝塞爾光束平面照明顯微鏡還因使用超薄層光（thin slices of light）“掃描”樣品，而非全部聚焦整個樣品，因而將光線造成的損傷zui小化并有助于延續(xù)樣品的生命。整個觀測過程非常迅速，在一秒鐘的時間內研究人員就可獲得200個詳細的影像，并在1-10秒鐘內生成由數百張二維影像組合形成的分辨率為0.3 μm的的三維圖像。

    在Janelia Farm的研究人員看來，貝塞爾光束平面照明顯微鏡的誕生對于基礎研究和顯微技術而言都是一個重要突破。因為它不僅比現(xiàn)有的顯微技術更加強有力，而且為生物學家研究完整生物系統(tǒng)提供了銳利武器。Betzig強調說，貝塞爾光束平面照明顯微鏡對于發(fā)育生物學研究和觀察細胞的三維結構特別有價值，科學家藉此可以獲得以往不可能得到的圖像，因此它必將拓展人類科學研究的能力。

來源：生物通