198．蘇州華宇牌超凈工作臺(tái)在茶多酚影響乳腺癌組織C-Jun 蛋白表達(dá)研究中的應(yīng)用發(fā)展

1 材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞系：雌性BALB/c 小鼠60 只，體重（20±2）g，購自上海斯克萊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK（滬）2003-0003]，并在南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)SPF 環(huán)境下飼養(yǎng)。EMT6 小鼠乳腺癌細(xì)胞購自*第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物：茶多酚購自浙江東方茶業(yè)有限公司，純度98％（批號(hào)：20050334）；人參皂苷Rg3（參一膠囊）每粒含人參皂苷Rg3 10 mg，購自吉林亞泰有限公司（批號(hào)：20040704）。
1.3 儀器：超凈工作臺(tái)系蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)（型號(hào)sa-cj-2FD）；離心機(jī)由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)（型號(hào)KA-1000）；萊卡倒置顯微鏡為德國(guó)萊卡公司產(chǎn)品（型號(hào) DMIL）；Forma 恒溫培養(yǎng)箱為美國(guó)Forma 公司產(chǎn)品（型號(hào)3111）。

1.4 試劑：c-jun Oncoprotein 抗體由美國(guó)CASTRATM 公司提供（批號(hào)：105205）；免疫組化超敏鼠組織試劑盒（UltraSensitiveTMS-P）購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與接種：EMT6 細(xì)胞用含10％ 小牛血清的RMPI1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后用0.25％胰酶消化，培養(yǎng)液吹打離心，收集細(xì)胞用PBS 稀釋，濃度調(diào)至5×106，每只小鼠以0.2 ml 接種于小鼠右后背部。12 天后腫瘤長(zhǎng)至1g 時(shí)移植。

2.2 腫瘤移植：斷頸處死荷瘤小鼠，75％酒精浸泡3～5min 后放于超凈工作臺(tái)平皿中，用高壓滅菌的手術(shù)器械剪開腫瘤皮膚，分離腫瘤包膜，取出腫瘤以消毒后的PBS 清洗，稱重，按每克腫瘤4ml 溶液的比例用生理鹽水稀釋。剪碎瘤體，充分勻漿制成細(xì)胞懸液，濃度調(diào)至2×106，每只小鼠于右后背部皮下接種0.2ml。

2.3 分組及用藥：接種第13 天腫瘤長(zhǎng)至1mm3 時(shí)（成瘤48 只），隨機(jī)分為4 組，即茶多酚灌胃組、茶多酚局部注射組、人參皂苷Rg3 灌胃組，模型對(duì)照組。每組12 只動(dòng)物。所有給藥劑量均采用人與動(dòng)物劑量換算法確定。即：①茶多酚灌胃組：按人治療量900mg/d 計(jì)算，換算成實(shí)驗(yàn)用藥中劑量為11.25mg/kg，并按小鼠體重20g 計(jì)算，以2.25mg/d 配置濃度5.625mg/ml，每天灌胃0.4ml。②茶多酚局部注射組：參考茶多酚腹腔注射LD50 160mg/kg劑量，取其1/4 量為實(shí)驗(yàn)用小劑量組，換算成實(shí)驗(yàn)用藥中劑量為12mg/kg，以2.4mg/d 配制濃度24mg/ml，每天局部注射0.1ml。③人參皂苷Rg3 組：按人治療腫瘤劑量40mg/d 計(jì)算，換算成20g 小鼠劑量為0.1mg/d，配制濃度為0.25mg/ml，每天灌胃0.4ml。④模型對(duì)照組：生理鹽水灌胃，每天0.4ml。在接種第13 天開始給藥、給水，每日1 次，連續(xù)給藥10 天。第11 天處死小鼠，取腫瘤組織制備切片待撿。

2.4 原癌基因蛋白C-Jun 檢測(cè)：將腫瘤組織取出后迅速放置于10%福爾馬林溶液中固定，第二天脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片為4um 厚，其中取一張做HE 染色，其余每組選取3 個(gè)組

織切片，按相關(guān)試劑盒說明檢測(cè)C-Jun 表達(dá)。用PBS 作為一抗做陰性對(duì)照。各組選取腫瘤組織3 個(gè)組織切片，每片選3 個(gè)視野，用美國(guó)TN-8502 圖像分析系統(tǒng)作圖像分析，測(cè)定光

密度（IOD）值，取其平均值，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ± s）表示。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.5 計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t 檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05 時(shí)表示差異有顯著性，當(dāng)P>0.05 時(shí)表示無統(tǒng)計(jì)意義。