在過(guò)去的十年中，DNA和RNA測(cè)序技術(shù)已迅猛發(fā)展并且更加便宜，現(xiàn)在它們被運(yùn)用到各種新的領(lǐng)域中。zui近在《Neuron》發(fā)表的一項(xiàng)新研究中，研究人員使用RNA測(cè)序技術(shù)，在單個(gè)神經(jīng)元水平上繪制小鼠的大腦圖。這種新技術(shù)被稱為Multiplexed Analysis of Projections by Sequencing (MAPseq)，可能比目前的方案更快和更容易。

這項(xiàng)研究的*作者、冷泉港實(shí)驗(yàn)室Anthony Zador教授的研究生Justus Kebschull說(shuō)：“有了MAPseq，我們?cè)噲D查明單個(gè)神經(jīng)元zui終到達(dá)哪里。”Zador的團(tuán)隊(duì)積極開(kāi)發(fā)MAPseq，因?yàn)槿狈Ω咄糠椒▉?lái)跟蹤單個(gè)神經(jīng)元。

在這項(xiàng)新的研究中，研究人員向一個(gè)選定的腦區(qū)，注射了一種含有大量RNA分子的失活病毒。每個(gè)RNA分子都有其*的“條碼”序列，每一個(gè)都在一個(gè)神經(jīng)元中結(jié)束，并通過(guò)軸突。幾天之后，研究人員解剖大腦，收集和測(cè)定來(lái)自不同腦區(qū)的RNA條形碼。

通過(guò)將來(lái)自注射腦區(qū)與其他腦區(qū)的RNA條碼進(jìn)行匹配，研究人員可以追蹤單個(gè)神經(jīng)元zui終到達(dá)哪里。Kebschull說(shuō)：“這是利用測(cè)序和條形碼用于高通量神經(jīng)解剖學(xué)的*個(gè)例子。”

快速地映射連接
弄清神經(jīng)元是如何連接的，是理解大腦如何運(yùn)作的一個(gè)重要組成部分。Kebschull說(shuō)：“如果你認(rèn)為大腦就像一臺(tái)計(jì)算機(jī)，我們就需要知道什么與什么連接在了一起，比如硬盤(pán)是否連接到了處理器。”

在目前的許多腦成像技術(shù)中，研究人員都是在神經(jīng)元中表達(dá)一種熒光標(biāo)記，并用顯微鏡觀察哪些大腦區(qū)域發(fā)光。但是Kebschull說(shuō)：“每一個(gè)腦區(qū)有數(shù)千個(gè)神經(jīng)元。”這些“批量跟蹤”方法不能區(qū)分單個(gè)神經(jīng)元，因此，研究人員無(wú)法區(qū)分兩個(gè)源神經(jīng)元zui終到了同一區(qū)域，還是不同的區(qū)域。這是重要的信息。“不同的神經(jīng)元可能具有不同的屬性，并可能攜帶不同的信息。”

其他的腦成像技術(shù)可以跟蹤單個(gè)神經(jīng)元，但這些方法都是勞動(dòng)密集型的和費(fèi)時(shí)的。Kebschull說(shuō)：“跟蹤一個(gè)單一的神經(jīng)元需要數(shù)周的時(shí)間。如果你想研究成千上萬(wàn)個(gè)神經(jīng)元，你基本上完蛋了。”相反，MAPseq用了一個(gè)星期的時(shí)間，就繪制出了一個(gè)注射腦區(qū)的幾千個(gè)神經(jīng)元圖，速度發(fā)生了一千倍的提升。

適應(yīng)現(xiàn)有的工具
Zador和他團(tuán)隊(duì)的靈感來(lái)自以前的腦成像技術(shù)，如Brainbow，研究人員隨機(jī)表達(dá)熒光標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記不同的神經(jīng)元，具有各種各樣多種的顏色（2）。但使用顯微鏡能夠容易區(qū)分的顏色數(shù)量有限，出于實(shí)際的目的，研究人員在這些模型中一次可以至多跟蹤10個(gè)神經(jīng)元。

Kebschull說(shuō)：“有了MapSeq，我們考慮從顏色切換到隨機(jī)核酸序列。”利用核酸條碼序列，將提供更多樣化的標(biāo)志物，使用目前的高通量測(cè)序方法，這些可能是非?？焖俸拖鄬?duì)便宜的讀數(shù)。從30個(gè)核酸序列的一段序列開(kāi)始，研究人員將zui終獲得1018個(gè)可能的序列，是小鼠大腦中神經(jīng)元數(shù)量的10個(gè)數(shù)量級(jí)以上。

在2012年，Zador建議使用條碼測(cè)序用于高通量的大腦映射，那么，研究人員必須弄清技術(shù)細(xì)節(jié)（3）。他們決定使用一種無(wú)效的Sindbis病毒——在神經(jīng)科學(xué)中常用的一種工具，來(lái)將條碼RNA序列運(yùn)送到小鼠的神經(jīng)元中。但他們馬上遇見(jiàn)了一種并發(fā)癥。

Kebschull說(shuō)：“人們認(rèn)為是非復(fù)制型的病毒，其實(shí)是復(fù)制型的。”因此，病毒粒子傳播超越了初級(jí)感染的神經(jīng)元，來(lái)標(biāo)記其他神經(jīng)元，這將使得映射分析變得復(fù)雜化。對(duì)于新技術(shù)，Kebschull制備了一種重組Sindbis病毒，能感染神經(jīng)元，但不傳播，為進(jìn)一步改進(jìn)鋪平了道路（4）。

一旦RNA條碼進(jìn)入神經(jīng)元，研究人員必須確保它們沿軸突運(yùn)輸?shù)剿鼈兊慕K端。為此，他們添加了一種工程化的蛋白質(zhì)，并表明它能有效地工作。此外，研究人員希望確保每個(gè)標(biāo)記的神經(jīng)元收到一個(gè)*的條碼，并且他們計(jì)算了必須注入多少病毒，才能實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。Kebschull和Zador也弄清了如何用高通量測(cè)序準(zhǔn)確地識(shí)別條形碼（5）。

測(cè)試技術(shù)
Zador的團(tuán)隊(duì)在小鼠大腦藍(lán)斑（LC）的一部分中測(cè)試了MAPseq，這個(gè)腦區(qū)是一種激素去甲腎上腺素的來(lái)源。去甲腎上腺素可調(diào)節(jié)警覺(jué)性和專注力，來(lái)自LC的神經(jīng)元是否延伸整個(gè)皮質(zhì)或只到達(dá)特定區(qū)域，尚不明確。Kebschull說(shuō)：“LC是一個(gè)很好的測(cè)試案例。”

使用MAPseq，研究人員發(fā)現(xiàn)從LC神經(jīng)元投射出許多各種各樣的圖案，一些神經(jīng)元到達(dá)一個(gè)特定的靶標(biāo)，其他神經(jīng)元?jiǎng)t伸展的更廣泛。因此，來(lái)自LC的去甲腎上腺素可以到達(dá)整個(gè)皮質(zhì)，以及在特定區(qū)域有更嚴(yán)重的影響，這與以前的研究結(jié)果一致。

目前的研究只使用一種病毒注射到LC，Zador和他的團(tuán)隊(duì)正在努力增加尋找其他病毒。zui終，他們希望利用MAPseq同時(shí)跟蹤整個(gè)皮層的神經(jīng)元。Kebschull說(shuō)：“我們正在擴(kuò)大這種方法，以開(kāi)展更多的高通量神經(jīng)解剖學(xué)。”研究人員還計(jì)劃在不同疾病的小鼠模型中使用MAPseq。“我們可以研究不同的自閉癥或發(fā)育疾病小鼠模型，以探析大腦的連接是如何錯(cuò)誤的。”

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