冷凍電子顯微技術(shù)（cryo-electron microscopy, cryo-EM）在結(jié)構(gòu)生物學領(lǐng)域發(fā)揮了越來越重要的作用。早在七八年前，清華大學就開始重視冷凍電鏡技術(shù)，投入了大量資金用于冷凍電鏡設(shè)施的建設(shè)。這個決定使清華在冷凍電鏡領(lǐng)域，無論是從科研設(shè)備還是人才成果等方面都躋身世界領(lǐng)水平。

近期來自清華大學生科院的施一公教授發(fā)表綜述：“Biological cryo-electron microscopy in China”，回顧了冷凍電鏡在中國的發(fā)展歷史，描述了目前的發(fā)展狀態(tài)，并展望了這種技術(shù)將會為生物學研究的各個領(lǐng)域帶來什么樣的影響。

在這篇文章中，施一公教授介紹了十多項近年來中國學者在電子顯微，冷凍電鏡上的重要成果，那么首先什么是冷凍電鏡呢？

在此前施教授的演講中他曾提到，冷凍電鏡就是把電子打在樣品上，經(jīng)過傅里葉變換，zui后收集圖象，進行particle classification（粒子分類），zui后重構(gòu)出一個三維的結(jié)構(gòu)。樣品是動態(tài)的，把樣品放在一個格柵上面，zui后把它弄得很薄，然后冷凍，不同的方向都會被保存下來，這樣透射電鏡透射以后這個投影會出現(xiàn)不同的圖像，然后通過三維的重構(gòu)把原始圖像放在一起。

一直以來，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有三種主要方法：X射線晶體衍射、核磁共振以及單顆粒冷凍電子顯微鏡（冷凍電鏡）。其中冷凍電鏡異軍突起如此之迅猛，2015年也成為Nature雜志評選的年度技術(shù)（Method of the Year），這兩年的革命性進展，一是它的照相機技術(shù)，二是其軟件分析的圖像處理技術(shù)，尤其是前者的進步大幅提高了冷凍電鏡的解析能力。另外幾前該領(lǐng)域出現(xiàn)了一項新技術(shù)突破：“直接電子檢測裝置”。這個裝置可以讓分辨率大大提高，為這項技術(shù)的應(yīng)用起到了至關(guān)重要的作用。

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)

大小為30nm的染色質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)的組織構(gòu)架與動態(tài)機制都在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中扮演了重要的角色，中科院生物物理研究所的朱平研究員曾于1999年在佛羅里達州大學從事冷凍電鏡的博士后研究工作，他一直致力于艾滋病病毒AIDS包膜糖蛋白ENV的研究，曾作為*作者在Nature上發(fā)文，利用冷凍電鏡詳細描述了AIDS病毒表面上的蛋白刺，這些蛋白刺可讓該病毒非常有效地與人體免疫細胞結(jié)合和融合。每個病毒體在每個粒子上平均有14個刺，其中的一些刺是聚集在一起的，這個特點與病毒組裝、感染及中和機制都有關(guān)系。

去年，其研究組在Science上發(fā)文，解析了30nm的高分辨率三維結(jié)構(gòu)并提出了一種全新的染色質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)模型。

在研究者“看”到的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中，DNA上每兩個相鄰的核小體通過中間連接的DNA“相對而望”，順著左手螺旋的方向讓DNA絲沿“Z”型路線往上堆疊，形成直徑30nm的染色質(zhì)絲——相鄰核小體間并沒有H1組蛋白的相互作用，但H1組蛋白在整個結(jié)構(gòu)的堆疊模式上起了很大的作用。這個結(jié)構(gòu)有力地印證了之前許多相關(guān)的實驗現(xiàn)象，與核小體的晶體結(jié)構(gòu)也有很高的一致性。不僅如此，這份3D“照片”推了之前科學界推測的模型：在這之前，科學家們普遍假設(shè)這段結(jié)構(gòu)是6個核小體圍成的“玫瑰花結(jié)”往復(fù)堆疊；而這項研究證實，真實結(jié)構(gòu)是每四個核小體為單位的左手螺旋。

免疫應(yīng)答受體

自1989年Charles Janeway在冷泉港會議上提出模式識別受體假說以來，在高等動物中迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三大家族的模式識別受體，分別是Toll-樣受體（TLR）、視黃酸誘導(dǎo)基因-樣受體（RLR）和Nod受體（NLR）。其中NLR是一種具有識別入侵病原體和激活先天免疫反應(yīng)重要功能的胞內(nèi)模式識別受體。 

清華大學生命科學學院的柴繼杰教授一直以來都對哺乳動物免疫監(jiān)控系統(tǒng)中的這些受體十分感興趣，2013年，他在Science雜志上發(fā)表文章，報道了小鼠NOD樣受體NLRC4自抑制狀態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)，并通過結(jié)構(gòu)分析和生化實驗揭示了該蛋白維持自抑制作用的分子機制，這也是NOD樣受體家族中*個被解析出的近乎全長的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)。
膜內(nèi)蛋白酶與γ-分泌酶

施一公教授自2005年開始就一直從事膜內(nèi)蛋白酶的研究，他曾利用X射線晶體技術(shù)解決了絲氨酸蛋白酶與鋅金屬蛋白酶的結(jié)構(gòu)難題，其*目標是γ-分泌酶，人體來源的γ-分泌酶與多種疾病有關(guān)，如阿茲海默癥。

2012年，清華大學的研究人員在Nature雜志上報告了一個presenilin/SPP家族膜內(nèi)天冬氨酸蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)。2014年7月，揭示出了人類γ-分泌酶的三維結(jié)構(gòu)，該研究對于深入了解γ-分泌酶的功能機制，開發(fā)出預(yù)防及治療阿爾茨海默氏癥及某些類型的癌癥的新型γ-分泌酶抑制劑具有重要的意義。相關(guān)論文發(fā)表在Nature雜志上。

2014年9月，施一公研究小組揭示出了γ-分泌酶組件nicastrin的晶體結(jié)構(gòu)，這為理解γ-分泌酶的組裝及工作機制，以及阿爾茨海默氏癥的發(fā)病機理提供了重要線索。研究結(jié)果發(fā)表在PNAS上。

2015年8月，施一公課題組與劍橋生物醫(yī)學院的研究人員合作，他們采用單顆粒冷凍電子顯微鏡獲得了完整人類γ-分泌酶（γ-secretase）的原子結(jié)構(gòu),研究結(jié)果發(fā)布Nature雜志上。這項研究為更深入地了解γ-分泌酶的功能機制奠定了分子基礎(chǔ)，對于開發(fā)出預(yù)防及治療阿爾茨海默氏癥的新型γ-分泌酶抑制劑具有重要的意義。

離子通道

清華大學的顏寧教授希望能解開骨骼肌與心肌中Na+和Ca2+離子通道的結(jié)構(gòu)謎題，2012年其研究組發(fā)表文章，解析了電壓門控鈉離子通道NavRh的三維晶體結(jié)構(gòu)，從結(jié)構(gòu)的角度報道了抑制離子鈣離子在電壓門控鈉離子通道的結(jié)合位點，也是獲得處于滅活構(gòu)象的電壓門控離子通道。這項工作不但為真核電壓門控鈉離子通道功能的進一步研究提供了有力的結(jié)構(gòu)依據(jù)，而且為該領(lǐng)域存在的重大爭議問題提供了結(jié)構(gòu)線索。此外，相對高性價比的純化和結(jié)晶方法，使得NavRh可以用來進行以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計和藥物篩選。

此后，在此技術(shù)上，顏教授研究組又在Science上發(fā)文，報道了真核生物電壓門控鈣離子通道的4.2埃分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。

他們利用單顆粒冷凍電鏡方法，重構(gòu)出了分辨率為4.2埃的兔源Cav1.1蛋白復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，展示了Cav1.1各個亞基的相互作用界面和亞基內(nèi)部結(jié)構(gòu)域的分布情況，揭示了各個輔助亞基（a2d，b，g）調(diào)控離子通道亞基（a1）的分子機理，為理解真核Cav和Nav的功能以及它們與疾病相關(guān)的機制提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

今年顏教授研究組在Nature上發(fā)表的文章在3.6 Å的標稱分辨率上，解析了兔Cav1.1復(fù)合物的冷凍電子顯微鏡結(jié)構(gòu)，報道了*真核電壓門控鈣離子通道的近原子分辨率三維結(jié)構(gòu)。

光合作用

植物光合作用由一系列光驅(qū)動，葉綠體膜上的多個超分子過程組合完成，其中綠色植物光系統(tǒng)II（PSII）的主要捕光復(fù)合物LHC-II是植物光合作用中主要的太陽能收集器，它負責吸收光能并將能量進一步傳遞給光反應(yīng)中心。

2004年，中科院生物物理所，植物所合作報道了菠菜主要捕光復(fù)合物 (LHC-II) 2.72 Å分辨率的晶體結(jié)構(gòu)，研究人員發(fā)現(xiàn)了膜蛋白結(jié)晶的一種全新方式，并報導(dǎo)了二十面體狀的膜蛋白—脂質(zhì)體復(fù)合物的空心球體的結(jié)構(gòu)。在這一結(jié)構(gòu)中，他們測定了包括蛋白質(zhì)分子、色素分子、脂分子和水分子在內(nèi)的近三萬個獨立原子的高精度三維坐標數(shù)據(jù)。結(jié)構(gòu)研究結(jié)果揭示了色素分子在LHC-II中的排布規(guī)律，建立了該復(fù)合體內(nèi)完整的能量傳遞網(wǎng)絡(luò)，并提出了一個基于結(jié)構(gòu)的光保護分子機理的模型。

時隔幾十年，當年參與研究的研究生柳振峰與常文瑞已經(jīng)在各自的領(lǐng)域取得了重要成果，今年前者在Nature上發(fā)文，報道了菠菜光系統(tǒng)II（Photosystem II）-捕光色素復(fù)合物(LHC-II)超級復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，分辨率為3.2埃（Å）。

核糖體生物合成

真核生物中核糖體合成是一個高度復(fù)雜的過程，涉及核仁、核質(zhì)和細胞質(zhì)中時空上受控的核糖體(r-protein)結(jié)合及核糖體RNA重塑等多個事件。

今年，清華大學生命科學學院的高寧研究員，和卡內(nèi)基梅隆大學的John L. Woolford合作，通過解析后期核pre-60S核糖體的結(jié)構(gòu)揭示出了裝配因子不同的作用。

研究人員利用低溫電子顯微鏡(cryo-EM)確定了采用表位標記裝配因子Nog2親和純化出的酵母核質(zhì)pre-60S粒子的結(jié)構(gòu)。他們的數(shù)據(jù)指出了20多種裝配因子的定位并確定了它們的結(jié)構(gòu)，其主要富集于兩個區(qū)域：一個從中心突起延伸至多肽隧道出口的區(qū)域，以及包含分開5.8S和25S核糖體RNAs的ITS2的一個結(jié)構(gòu)域。

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