細(xì)胞：Colon26細(xì)胞
中文名稱：小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞
生長(zhǎng)特性：貼壁細(xì)胞
培養(yǎng)基：1640 培養(yǎng)基 血清：10%FBS(GIBCO胎牛血清)
凍存條件：50%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、40% FBS、10% DMSO
細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)傳代流程( 請(qǐng)嚴(yán)格遵照無菌操作)
1. 吸出原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，PBS 緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞兩次，加 2-3 ml 0.25% 胰_酶進(jìn)行消化細(xì)胞(注意把握消化時(shí)間，通?？刂圃?1-2min)
2. 鏡下觀察消化情況，在細(xì)胞邊緣縮小，貼壁松動(dòng)時(shí)(不建議消化到細(xì)胞漂浮)去掉胰_酶，加 6~8ml 培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞層，盡量把細(xì)胞層吹落，吹散。
3. 取部分細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿/瓶中，添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，把細(xì)胞懸液打勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4. 注意培養(yǎng)基 PH 值變化情況，定期換液(每周 2-3 次)，待細(xì)胞密度達(dá)到 80%以后重復(fù) 1 項(xiàng)操作或凍存。
(網(wǎng)絡(luò)信息主針對(duì)網(wǎng)絡(luò)推廣作用，僅供參考，細(xì)胞培養(yǎng)請(qǐng)咨詢細(xì)胞庫管理員，以細(xì)胞庫管理員提供給您的信息為準(zhǔn)，操作前，如果有不明白之處，先咨詢細(xì)胞庫管理員，避免不必要的損失；)
細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)生產(chǎn)的質(zhì)量控制對(duì)細(xì)胞的生存是非常重要的，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分子伴侶calnexin/calreticulin循環(huán)保證只有正確折疊的糖蛋白才能到達(dá)它們的目的地。
而錯(cuò)誤折疊的糖蛋白則通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)降解途徑(ERAD-ER-associated degradation)進(jìn)行降解。ERAD使蛋白質(zhì)被逆向定位到細(xì)胞質(zhì)中，再被蛋白酶解體進(jìn)行降解。
以前發(fā)現(xiàn)一個(gè)跨膜的缺失甘露糖苷酶活性的alpha類甘露糖苷酶I型蛋白-EDEM(a transmembrane-mannosidase-I-like protein that lacks mannosidase activity)能夠加速ERAD的活性。
N鏈接多糖Glc1Man9GlcNAc2的糖蛋白能夠與calnexin或calreticulin進(jìn)行結(jié)合，由這兩個(gè)分子伴侶來促進(jìn)它們的折疊，如果加入葡萄糖則能夠干擾這個(gè)過程。
但當(dāng)折疊沒有完_全的時(shí)候，游離的糖蛋白或者由糖基轉(zhuǎn)移酶繼續(xù)糖基化然后由分子伴侶促進(jìn)折疊，或者被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的alpha甘露糖苷酶I作用產(chǎn)生Man8GlcNAc2而將糖蛋白導(dǎo)向ERAD的降解途徑。
Nagata and colleagues在第一篇文章中發(fā)現(xiàn)EDEM與跨膜的分子伴侶calnexin作用，而不與可溶性的分子伴侶calreticulin，而且calnexin的跨膜區(qū)對(duì)它們的相互作用是必需的。
研究者用ERAD途徑降解的底物之一NHK(an α1-antitrypsin variant)分析發(fā)現(xiàn)，EDEM和NHK與calnexin的結(jié)合和底物從calnexin上的釋放對(duì)于EDEM介導(dǎo)的ERAD途徑是必需的。而且EDEM可以通過促進(jìn)底物從calnexin的釋放來加速ERAD途徑。
發(fā)現(xiàn)過表達(dá)EDEM的水平不僅僅加速了膜結(jié)合的ERAD底物降解，也加速了可溶性的ERAD底物降解。而且當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的EDEM水平降低時(shí)ERAD底物降解被減慢了。
他們的工作對(duì)于EDEM在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成過程中的質(zhì)量控制機(jī)制有了初步的探討。
