細(xì)胞：FRH-0201細(xì)胞
中文名稱：人膽管癌細(xì)胞
生長特性：貼壁細(xì)胞
培養(yǎng)基：1640 培養(yǎng)基 血清：10%FBS(GIBCO胎牛血清)
凍存條件：50%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、40% FBS、10% DMSO
細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)傳代流程( 請(qǐng)嚴(yán)格遵照無菌操作)
1. 吸出原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，PBS 緩沖液潤洗細(xì)胞兩次，加 2-3 ml 0.25% 胰_酶進(jìn)行消化細(xì)胞(注意把握消化時(shí)間，通?？刂圃?1-2min)
2. 鏡下觀察消化情況，在細(xì)胞邊緣縮小，貼壁松動(dòng)時(shí)(不建議消化到細(xì)胞漂浮)去掉胰_酶，加 6~8ml 培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞層，盡量把細(xì)胞層吹落，吹散。
3. 取部分細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿/瓶中，添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，把細(xì)胞懸液打勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4. 注意培養(yǎng)基 PH 值變化情況，定期換液(每周 2-3 次)，待細(xì)胞密度達(dá)到 80%以后重復(fù) 1 項(xiàng)操作或凍存。
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篩選了約50,000個(gè)化學(xué)小分子。就像一個(gè)普通的圖書館里收藏有各種不同的圖書一樣，這個(gè)組合文庫中也包含了各種不同的有機(jī)小分子化合物。
通過這次篩選分類，發(fā)明了一種新方法來識(shí)別具有控制干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的能力的分子。
他們將一個(gè)編碼熒光素酶的報(bào)告基因?qū)肱咛バ园┘?xì)胞中，使該基因插入到一個(gè)只在神經(jīng)元中表達(dá)的基因的啟動(dòng)子序列下游。然后研究人員將這些胚胎性癌細(xì)胞放置到培養(yǎng)板獨(dú)立的小孔內(nèi)，每個(gè)孔內(nèi)添加文庫中不同的小分子。
如果任何小孔中有經(jīng)過改造的胚胎性癌細(xì)胞被誘導(dǎo)為神經(jīng)元，這些神經(jīng)元就會(huì)表達(dá)熒光素酶，發(fā)出熒光。胚胎性癌起源于具有多分化潛能的原始sheng殖細(xì)胞，為高度惡性腫瘤，發(fā)病高峰在30～40歲，嬰兒及兒童也可發(fā)生。
一旦發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞經(jīng)某種小分子處理后分化為神經(jīng)元，就用精確度更高的測(cè)定方法來進(jìn)一步證實(shí)，包括用特殊標(biāo)記對(duì)細(xì)胞染色，顯微鏡下檢查個(gè)體細(xì)胞形狀等。神經(jīng)元具有獨(dú)_特的圓形胞體和不對(duì)稱的分裂過程。
最后，篩選出一些能誘導(dǎo)神經(jīng)元分化的分子，而他們選取其中一個(gè)叫做TWS119,的小分子進(jìn)行深入研究。
當(dāng)他們檢查TWS119誘導(dǎo)神經(jīng)元分化的詳細(xì)過程時(shí)，發(fā)現(xiàn)該分子與一種細(xì)胞激酶--糖原合成激酶-3beta (GSK-3beta)結(jié)合。GSK-3beta是一種多功能信號(hào)傳導(dǎo)酶，與一些生理信號(hào)傳導(dǎo)過程有關(guān)，并通過附加一個(gè)磷酸基到酶上，調(diào)節(jié)其它酶的活性。
操縱GSK-3beta會(huì)誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元，--這一事實(shí)揭示了干細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化過程中復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的一些基本信息。TWS119調(diào)節(jié)GSK-3beta活動(dòng)這一事實(shí)又說明，TWS119可能為了解控制干細(xì)胞命運(yùn)的機(jī)制提供新線索，最終用于體內(nèi)干細(xì)胞療法。
Schultz 和 Ding正著手研究探明這種結(jié)合如何引導(dǎo)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的確切機(jī)制。
