目的： 建立利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)小鼠MAD2L1基因第二外顯子基因編輯的方法體系，并分析CRISPR/Cas9對(duì)MAD2L1基因編輯的脫靶效應(yīng)。

方法： 通過CHOPCHOP設(shè)計(jì)位于小鼠MAD2L1基因第二外顯子的靶點(diǎn)序列，并構(gòu)建Cas9-MAD2L1載體，將該載體轉(zhuǎn)染到NIH/3T3細(xì)胞中，通過嘌呤霉素篩選并結(jié)合熒光顯微鏡觀察GFP后，提取細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的基因組DNA，利用PCR方法，結(jié)合T7E1分析和桑格爾測(cè)序，鑒定對(duì)小鼠MAD2L1基因編輯情況，并對(duì)轉(zhuǎn)染后的NIH/3T3細(xì)胞進(jìn)行CRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)分析。

結(jié)果： 將Cas9-MAD2L1載體轉(zhuǎn)染到NIH/3T3細(xì)胞并進(jìn)行嘌呤霉素篩選后，熒光顯微鏡下觀察到大量表達(dá)GFP的細(xì)胞，PCR結(jié)合T7E1結(jié)果顯示，以轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞DNA為模板擴(kuò)增出的228 bp MAD2L1 PCR產(chǎn)物，可被酶切成166 bp和62 bp片段，測(cè)序結(jié)果顯示，成功對(duì)MAD2L1基因第二外顯子靶點(diǎn)處進(jìn)行基因編輯，脫靶效應(yīng)分析未檢測(cè)到CRISPR/Cas9有對(duì)脫靶位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯。

結(jié)論： 成功建立對(duì)小鼠MAD2L1基因第二外顯子進(jìn)行基因編輯的方法體系，設(shè)計(jì)的對(duì)MAD2L1基因編輯靶點(diǎn)未檢測(cè)到脫靶效應(yīng)的發(fā)生。