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菲亞——細(xì)胞冷凍保存的方法

2019-3-20  閱讀(1091)

1、材料:
生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO(Sigma D-2650)、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片、等速降溫機(jī)(KRYO10SeriesII)。
2、冷凍保存方法:
(1)傳統(tǒng)方法:冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16~18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1小時(shí),以防止冰晶過大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 
(2)程序降溫:利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。 
3、步驟: 
(1)冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基,觀察細(xì)胞生長情形。 
(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制):將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中,后濃度為5~10%,混合均勻,置于室溫下待用。
(3)依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作,收集培養(yǎng)之細(xì)胞,取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
(4)離心,去除上清液,加入適量冷凍保存溶液,使細(xì)胞濃度為1~5×106cells/ml,混合均勻,分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中,1ml/vial,并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。 
4、注意事項(xiàng): 
(1)欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài),約為80–90%致密度。
(2)冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì),例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。
(3)注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級等級,無菌且無色(以0.22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品,如Sigma D-2650),以5~10ml小體積分裝,4℃避光保存,勿作多次解凍。
(4)冷凍保存之細(xì)胞濃度:
①normal human fibroblast:1~3×106cells/ml 
②hybridoma:1~3×106cells/ml,細(xì)胞濃度不要太高,某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后死*。 
③adherent tumor lines:5~7×106,依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度,而HeLa只需1~3×106cells/ml 
④other suspensions:5~10×106cells/ml,human lymphocyte須至少5×106cells/ml。 
(5)冷凍保護(hù)劑濃度為5或10%DMSO,若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時(shí),亦應(yīng)作一個(gè)backup culture,以防止冷凍失敗。



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