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RT-PCR實(shí)驗(yàn)RNA的質(zhì)量確認(rèn)方法
2023-12-25 閱讀(356)
RT-PCR實(shí)驗(yàn)RNA的質(zhì)量確認(rèn)方法：
1、檢測RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。
1.82.0時(shí)，我們認(rèn)為RNA中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染是可以容忍的，不過要注意，當(dāng)你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時(shí)，R值可能會(huì)大于2（一般應(yīng)該是<2.2的）。當(dāng)R<1.8時(shí)，溶液中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染比較明顯，你可以根據(jù)自己的需要決定這份RNA的命運(yùn)。當(dāng)R>2.2時(shí)，說明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。
如果RNA的量夠，可在260nm（A260）用分光光度法測定RNA的得率，1個(gè)單位等于40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比值為2.0。A260/A230的比值還表明RNA的純度，其值小于2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇?xì)埩?，其值大?/span>2.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA。
2、RNA的電泳圖譜
一般的，RNA的電泳都是用變性膠進(jìn)行的，但是根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，如果你僅僅是為了檢測RNA的質(zhì)量是沒有必要進(jìn)行如此麻煩的實(shí)驗(yàn)的，用普通的瓊脂糖膠就可以了。
電泳的目的是在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量是好的。
以上是我們常用的兩種方法，但是這兩種方法都無法明確的告訴我們RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我們很難察覺，但是大部分后續(xù)的酶學(xué)反應(yīng)都是在37度以上并且是長時(shí)間進(jìn)行的。這樣，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中就會(huì)有非常適合的環(huán)境和時(shí)間發(fā)揮它們的作用了，當(dāng)然這時(shí)你的實(shí)驗(yàn)也就完了。
下面，我們介紹一個(gè)可以確認(rèn)RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。
3、保溫試驗(yàn)
方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補(bǔ)充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
時(shí)間到了之后，取出兩份樣本進(jìn)行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當(dāng)然，它們的條帶也要符合方法2中的條件），則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質(zhì)量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。
如果你的RNA樣本通過了保溫實(shí)驗(yàn)的檢測并且你在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中還是非常小心的防范RNA酶的騷擾，那么你的實(shí)驗(yàn)應(yīng)該是很難失敗了！
