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原代細(xì)胞分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)流程
2024-11-18 閱讀(194)
原代細(xì)胞（Primary cells）：是指直接從機(jī)體取出的組織或細(xì)胞獲得單個(gè)細(xì)胞并在體外進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞。原代細(xì)胞培養(yǎng)是指將組織從動(dòng)物體內(nèi)取出，經(jīng)各種酶、螯合劑(常用EDTA) 或機(jī)械方法剪碎處理，分散成單細(xì)胞，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖的過程。細(xì)胞的分離純化和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。我們通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞。
原代細(xì)胞分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)流程:
首先將組織從機(jī)體中取出，經(jīng)yi 蛋白酶/膠原酶處理后分散成單細(xì)胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞繁殖到一定系數(shù)后進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
實(shí)驗(yàn)流程:
1. 取材：將目標(biāo)動(dòng)物麻醉或處死，動(dòng)物體上取出目標(biāo)器官或組織。
2. 原代細(xì)胞的分離：獲取的組織或器官中含有血液和多種細(xì)胞，我們將獲取的組織或器官在無菌環(huán)境下充分剪碎，消化，分散成單細(xì)胞。根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞的特點(diǎn)選擇不同的篩選方法， 以獲得目標(biāo)細(xì)胞。
3. 培養(yǎng)和鑒定：根據(jù)客戶的需求，爾丙生物將獲得的高純度原代細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代培養(yǎng)，也可以凍存處理，滿足不同的實(shí)驗(yàn)需求。
常用的原代培養(yǎng)法有組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法。許多實(shí)驗(yàn)室喜歡用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)，因?yàn)榉椒ê唵危?xì)胞也較容易生長。尤其是培養(yǎng)心肌，有時(shí)還可觀察到心肌組織塊搏動(dòng)。細(xì)胞從組織塊邊緣向外長出并鋪滿培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶后， 即可進(jìn)行傳代。
下面介紹織塊培養(yǎng)法：
1. 操作步驟
（1）、在無菌條件下，取待培養(yǎng)的組織適量，置入小燒杯中， 以適量Hanks 溶液清洗2~3 次，去掉組織塊表面的血污。
（2）、用眼科剪將組織塊反復(fù)剪成0.5~ 1mm3的小塊。
（3）、再用Hanks 溶液反復(fù)漂洗， 直至液體不混濁為止。等組織塊下沉，將燒杯傾斜，用小吸管盡量吸除Hanks 溶液。
（4）、用含20%滅活血清及雙抗溶液(200U/ml 青霉su、200μg/ml 鏈霉su）的培養(yǎng)液再清洗，用吸管吸干后加入5ml 含20％血清的培養(yǎng)液。
（5）、用彎頭吸管吸取組織小塊，均勻地置于培養(yǎng)皿內(nèi)表面，吸去多余的培養(yǎng)液，各組織小塊之間相距0.5cm 為宜。蓋好培養(yǎng)皿蓋，做好標(biāo)記， 置37°C 的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。
（6）、2~4h 后，于超凈工作臺(tái)中，緩緩地向培養(yǎng)皿中加入上述含20％血清及雙抗溶液( 100U/ml 青霉su及100μg/ml 鏈霉su）的培養(yǎng)液少量，以使組織塊浸沒在培養(yǎng)液中。
（7）、輕輕地將培養(yǎng)皿及組織塊移至CO2 培養(yǎng)箱， 如無特殊情況，不必觀察。1~2 周后，可觀察到細(xì)胞從組織塊邊緣長出，形成生長暈。
（8）、 一般說來，若培養(yǎng)液無明顯改變， 1 周換液1 次即可。待細(xì)胞長滿整個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)表面，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
2. 注意事項(xiàng)
（1）、如果是用培養(yǎng)瓶而不是培養(yǎng)皿，則接種組織塊千培養(yǎng)瓶底壁后， 要輕輕地翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，令瓶底在上，蓋好瓶蓋后輕輕置入37°C 的CO2 培養(yǎng)箱， 2~4h 后，取出培養(yǎng)瓶，在超凈工作臺(tái)內(nèi)打開瓶蓋，仍令組織塊在上方。在組織塊對(duì)面瓶壁加入適量上述培養(yǎng)液。然后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓組織塊浸沒于培養(yǎng)液中。蓋好瓶蓋后放回二氧化碳孵箱，繼續(xù)培養(yǎng)。
（2）、從培養(yǎng)皿表面游離下來的組織塊，棄去即可。
（3）、如果使用玻璃培養(yǎng)瓶，而不是新的塑料培養(yǎng)瓶，則最好在玻璃底表面包被大鼠鼠尾膠原，這樣不但有利于組織塊的黏附，而且可使細(xì)胞生長得更好。
（4）、本方法適于各種組織的培養(yǎng)，操作者還可根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要和細(xì)胞種類加以修改。
