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上海博湖生物科技有限公司
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流式抗體的選擇使用
2022-1-5 閱讀(997)
隨著流式細(xì)胞術(shù)的日益發(fā)展，流式抗體及熒光標(biāo)記產(chǎn)品的種類、數(shù)量也在不斷增多，加上多色分析實(shí)驗(yàn)方案需求的增長，逐漸產(chǎn)生了抗體難選擇、熒光難搭配等問題，如何選擇合適的流式抗體，也成為了流式技術(shù)是否能成功的關(guān)鍵因素之1。
流式抗體的選擇：
1、流式抗體本身也是抗體，所以選擇流式抗體定要滿足抗體選擇最基本的條件：目標(biāo)蛋白特異性，反應(yīng)種屬以及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。
2、流式抗體熒光標(biāo)記的方式包括直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種。在流式實(shí)驗(yàn)過程中，盡量減少實(shí)驗(yàn)工序和過程，以保證實(shí)驗(yàn)的真實(shí)和準(zhǔn)確性。因此在條件允許的范圍內(nèi)，建議盡量用直接標(biāo)記的抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)而不去做間接標(biāo)記。
3、流式抗體熒光標(biāo)記的選擇：如果實(shí)驗(yàn)中檢測單指標(biāo)：不同熒光標(biāo)記在不同的儀器上強(qiáng)度不同。FACS Calibur儀器為例：PE ＞APC ＞PE-Cy5 ＞PerCP ＞FITC ＞PerCP-Cy5.5，通常來說，PE*，適用于弱表達(dá)抗原。FITC強(qiáng)度較弱，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原，使用范圍比較廣。用戶需根據(jù)檢測的目標(biāo)蛋白進(jìn)行具體選擇。如果同時(shí)檢測多個(gè)指標(biāo)：確認(rèn)流式細(xì)胞儀能檢測多少個(gè)通道：流式抗體每個(gè)通道只能選擇1種熒光素。各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配。如：實(shí)驗(yàn)者同時(shí)檢測三個(gè)指標(biāo)，可以在圖1中綠色、黃色和紅色三個(gè)通道中各選個(gè)適當(dāng)?shù)臒晒馑貥?biāo)記，F(xiàn)ITC、PE和PE-cy5。切忌所有指標(biāo)選擇同個(gè)通道的熒光標(biāo)記，以防止熒光的重疊和相互干擾，影響最后結(jié)果。因此，流式細(xì)胞儀的通道越多，同份樣本能同時(shí)做的表面/胞內(nèi)標(biāo)志就越多。常用熒光標(biāo)記包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。
流式抗體的選擇使用注意事項(xiàng)：
1、建議實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的數(shù)量和抗體的比例要適當(dāng)。細(xì)胞過量或抗體過量都可能使實(shí)驗(yàn)結(jié)果受影響，因此需要優(yōu)化試驗(yàn)條件。注：不同的流式技術(shù)對抗體的需求量有較大差異，例如傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)（采用鞘液流系統(tǒng)）需要1×106個(gè)細(xì)胞為起始上樣量，抗體用量為10μl，而微流式細(xì)胞術(shù)則只需5×105個(gè)細(xì)胞，抗體用量減少到5μl。
2、 直標(biāo)的流式抗體應(yīng)該4℃避光保存，不要冷凍。
3、 盡量選擇經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的流式抗體，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
