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蔗糖合成酶SS-I(分解方向)試劑盒,微板法

蔗糖合成酶SS-I(分解方向)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 蔗糖合成酶（分解方向；SS-Ⅰ）試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS3150W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 蔗糖是葉片等光合產(chǎn)物向各器官運(yùn)輸?shù)闹饕螒B(tài)。蔗糖合成酶（Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13）是雙向反應(yīng)酶，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之 一。研究其分解方向 SS-Ⅰ的活性對(duì)于植物蔗糖降解以及淀粉合成具有重要意義。 SS-Ⅰ催化蔗糖和UDP生成游離果糖和UDPG，采用3,5－二硝基水楊酸法在540nm測定果 糖的含量來反映酶活性的高低。 二、測試盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 A：液體 1.1mL×2 支 B：粉體 mg×2 支 4℃保存 臨用前一支 A 液全部轉(zhuǎn)移至一 支 B 粉體中，溶解待用， 仍-20℃保存。 -20℃保存 試劑二 液體 1.5mL×1 支 4℃保存 試劑三 液體 6mL×1 棕色瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋、移液器、蒸餾水。 四、蔗糖合成酶（分解方向；SS-Ⅰ）活性檢測： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，在 4oC 或冰浴進(jìn)行 勻漿(或使用各類常見電動(dòng)勻漿器)。12,000rpm，4oC 離心 10min，取上清作為待測樣品。 【注意】 若樣本含糖量高，可引起 A 對(duì)照值較大如超過 1.6，即檢測背景值過高會(huì)影響檢測，可在樣本 制備過程中增加除糖步驟：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷的 95%乙醇 冰浴勻漿，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀，向沉淀中加入經(jīng)預(yù)冷的 80% 乙醇混勻，4℃放置 5min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀。再向沉淀中加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷 提取液渦旋混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 10min；留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測。 ② 液體樣本：直接測定。 若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對(duì)照管 試劑一 40 蒸餾水 40 樣本 10 10 37℃準(zhǔn)確水浴 30min 后，95℃水浴 5min 試劑二 10 10 試劑三 50 50 95℃水浴 10min（可用封口膜纏緊，防止水份散失），本試劑盒僅供科研使用 2 取出后冰浴或淋浴至室溫 蒸餾水 200 200 混勻，取 200μL 至 96 孔板中，540nm 下測定各管吸光值。 ΔA=A 測定管-A 對(duì)照管（每個(gè)測定管都需設(shè)一個(gè)對(duì)照管）。 【注】：1. 若ΔA 值過小如在零附近徘徊，可增加樣本的加樣體積 V1（如 20μL，則蒸餾水相應(yīng)減少） 或增加樣本取樣量 W（如增至 0.2g），或者延長 37℃水浴時(shí)間 T（如 40min 或更長），相 應(yīng)的變量重新代入計(jì)算公式計(jì)算。 2. 若 A 測定的值大于 1.5，則可對(duì)加入 96 孔板前的的液體用蒸餾水稀釋，則稀釋倍數(shù) D 需 代入計(jì)算公式計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0128x - 0.0324；x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（μg），y 為ΔA。 2、按照蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 μg 果糖定義為一個(gè)酶活力單位。 SS-Ⅰ活性(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0324)÷0.0128]÷(V1×Cpr)÷T ×D =260.42×(ΔA+0.0324) ÷Cpr×D 3、按照樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 μg 果糖定義為一個(gè)酶活力單位。 SS-Ⅰ活性(μg/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0324)÷0.0128]÷(W×V1÷V)÷T×D =260.42×(ΔA+0.0324)÷W×D 4、按照液體體積計(jì)算： 單位定義：每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生 1 μg 果糖定義為一個(gè)酶活力單位。 SS-Ⅰ活性(μg/min/mL)=[(ΔA+0.0324)÷0.0128]÷V1÷T×D =260.42×(ΔA+0.0324)×D V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.01 mL； T---反應(yīng)時(shí)間，30 min； W---樣本質(zhì)量，g； D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（10mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 2, 4, 6, 8, 10. mg/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來 調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)對(duì)照管加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。