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鳥(niǎo)an酸轉(zhuǎn)氨酶(OAT)試劑盒,微板法

鳥(niǎo)an酸轉(zhuǎn)氨酶(OAT)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 鳥(niǎo)*酸轉(zhuǎn)氨酶（OAT）測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS7011W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 鳥(niǎo)*酸轉(zhuǎn)氨酶（OAT，EC 2.6.1.13）是以鳥(niǎo)*酸為前體合成脯*酸的關(guān)鍵酶, 對(duì)植物 適應(yīng)逆境脅迫起關(guān)鍵作用 鳥(niǎo)*酸轉(zhuǎn)氨酶（OAT）在底物鳥(niǎo)*酸和α-酮戊二酸存在下，使鳥(niǎo)*酸脫氨并伴隨著 NADH 的氧化，通過(guò)檢測(cè) NADH 在 340nm 處吸光值的下降量，即可計(jì)算得出鳥(niǎo)*酸轉(zhuǎn) 氨酶的酶活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、鳥(niǎo)*酸轉(zhuǎn)氨酶（OAT）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn)樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、 樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清液待用。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：澄清的液體樣本直接檢測(cè)，若渾濁則離心后取上清檢測(cè)。 2、 上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm。 ② 所有試劑解凍至室溫。 ③ 在 96 孔板依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 20 試劑一 10 試劑二 20 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×3 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 0.5mL 蒸餾水溶解備用，用 不完的試劑分裝后-20℃保存，禁 反復(fù)凍融，三天內(nèi)用完。 試劑二 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 5mL 蒸餾水溶解備用 試劑三 液體 14mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 5mL 蒸餾水溶解備用本試劑盒僅供科研使用 2 試劑三 130 室溫（25℃）放置 5min 試劑四 20 混勻，立即于 340nm 處檢測(cè)，10s 時(shí)讀取 A1，15min 后讀取 A2，△A= A1-A2。 【注】1.若△A 的值在零附近，可以適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到 30min 后或更長(zhǎng)讀取 A2，改變后的反應(yīng)時(shí) 間需代入計(jì)算公式重新計(jì)算?；蜻m當(dāng)加大樣本量，則改變后的加樣體積需代入計(jì)算公式 重新計(jì)算。 2. 若起始值 A1 太大如超過(guò) 2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高，則起始值相對(duì)會(huì)偏 高），可以適當(dāng)減少樣本加樣量，則改變后的加樣體積需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 或向待測(cè)樣本中加少許活性炭混勻靜置 5min 后 12000rpm, 4℃離心 10min，上清液用于檢測(cè)； 3. 若下降趨勢(shì)不穩(wěn)定，可以每隔 20S 讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時(shí)間段來(lái)參與 計(jì)算，相對(duì)應(yīng)的 A 值也代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘內(nèi)氧化 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 OAT 活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(V1×Cpr) ÷T =214.4×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每分鐘內(nèi)氧化 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 OAT 活力（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(W×V1÷V)÷T =214.4×ΔA÷W 3、按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 單位定義：每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘內(nèi)氧化 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活單位（U）。 OAT 活力(nmoL/min/104 cell)= [ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.43×ΔA 4、液體中 OAT 活力的計(jì)算: 單位定義：每毫升液體每分鐘內(nèi)氧化 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 OAT 活力（nmol/min/mL）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷V1÷T =214.4×ΔA V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.02mL； V2---反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L； d---96 孔板光徑，0.5cm； ε---NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量； T---反應(yīng)時(shí)間，15min； Cpr---蛋白濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測(cè)定試劑盒。