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實驗方法原理 針對轉(zhuǎn)基因大豆基因組中被導入的35S啟動子、NOS終止子和CP4-EPSPS抗草甘膦基因等外源基因，自行設計了兩對引物，采用雙重PCR同時擴增上述基因，用8g/L羥丙基甲基纖維素為篩分介質(zhì)，在50cm×100μm i．d．涂壁毛細管中，于一10kV電壓下用激光誘導熒光-毛細管電泳檢測轉(zhuǎn)基因大豆的PCR擴增產(chǎn)物。
實驗材料 陽性抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆標準物質(zhì)進口轉(zhuǎn)基因大豆樣品非轉(zhuǎn)基因大豆寡核苷酸引物
試劑、試劑盒 溴乙錠羥丙基甲基纖維素三羥甲基氨基甲烷Sulforhdamine B三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸硼酸Taq DNA 聚合酶dNTPspUC19DNA Msp I(HpaⅡ)Marker
儀器、耗材 毛細管電泳-激光誘導熒光檢測裝置石英毛細管UNO 型PCR儀PAC3000型電泳儀UVI紫外成像分析儀
實驗步驟 
1.總DNA提取

用CTAB法提取植物總DNA.

2.PCR體系及反應條件

雙重PCR反應體系：1×buffer,2.5mmol/L MgC12,0.25mmol/L dNTP,primers（0.4 μmol/L ZY1-35S,ZY2-EPSPS和0.4 μmol/L ZY3-NOS,ZY4-NOS），1.5units of Taq DNA Polymerase（MBI），模板DNA100——200ng,總反應體積25μ1.PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預變性3min;95℃ 45s,55℃ 60s,72℃ 45s,共35個循環(huán);72℃延伸5min.

內(nèi)源基因（Lectin）的PCR 反應體系：1×buffer,2.0mmol/L MgC12,0.2mmol/L dNTP,0.2μmol/L primers.1.0 units of Taq DNA Polymerase（MBI），模板DNA1O0——200ng,總反應體積25μ1.PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預變性3min;95℃ 45s,58℃ 60s,72℃ 45s,共35個循環(huán);72℃延伸5min.

3.PCR產(chǎn)物的毛細管電泳 在電泳分析前，先將毛細管柱填充1g/L HPMC,再充以含有3.75μmol/L溴乙錠的8g/L HPMC,電泳分離的緩沖溶液為TBE溶液（45mmol/L Tris,45mmol/L boric acid,1 mmol/L EDTA,pH 8.5）。取PCR擴增產(chǎn)物1Oμl加入內(nèi)標2×0.0001mol/L Sulforhdamine B溶液0.5μl,在-1OkV下電動進樣20 s,并在-1OkV下恒壓電泳，用543.5nm 波長的激光激發(fā)DNA段與溴乙錠的結合物產(chǎn)生熒光，在590nm波長下檢測。電泳溫度為20℃。每次電泳后用0.01 mol/L H3PO4溶液沖洗毛細管5min,再進行下一次檢測。pUC19DNA/Msp I（HpaⅡ）Marker用作DNA marker,使用時Maker用適量無菌水稀釋。電泳圖譜和實驗數(shù)據(jù)用C++語言編制的windows軟件進行采集和分析處理。

4.PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳 將5μl PCR產(chǎn)物與1μl上樣buffer混合后上樣于30g/L瓊脂糖凝膠中（含0.1μg/ml溴化乙錠）。在0.5×TBE電泳緩沖液中，于100V電壓下，電泳50min,采用pUC19DNA/Msp I（HpaⅡ）DNA Marker同時電泳，然后用UVI紫外成像分析儀觀察結果。

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注意事項 
1.內(nèi)徑為100μm的毛細管對DNA 片段標準物質(zhì)pUC19DNA/Msp I（Hpa Ⅱ）Marker 中的110（111）/147 bp DNA 片段的分離度可達2.91,而且內(nèi)徑為100μm的毛細管柱檢測光程較大，因而較內(nèi)徑為50μm和75μm的毛細管柱的檢測靈敏度高。采用內(nèi)徑為100μm的毛細管柱，減少其長度至40cm,對110（111）/147bp標準DNA段的分離度減少至2.13.因此本實驗選用50cm×100μm i.d.的毛細管進行電泳分離。

2.隨著纖維素質(zhì)量濃度的增加，對DNA段的分離能力越好，當膠質(zhì)量濃度達到8g/L時，110/147bpDNA段的分離度大（R=2.91）。繼續(xù)增加膠的質(zhì)量濃度，分離度變化不大，但篩分介質(zhì)的粘度增大，分析時間延長。故本實驗選用HPMC為8g/L.

3.不同大小的DNA標準片段的遷移時間均隨場強的升高而減小。對于147bp DNA段，柱效的考察結果顯示，在場強為150V/cm——200V/cm 時具有高理論塔板數(shù)2.3×1O0000.當電場強度高于200V/cm時，遷移時間變短，但焦耳熱效應也較為顯著，從而引起譜帶的展寬，在一定程度上降低了柱效，使分離度降低。為了進行快速分離，我們選用在較高的場強200V/cm下進行電泳分析。

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其他 
1.遷移時間的重現(xiàn)性

DNA段遷移時間的重現(xiàn)性是基因分析中的重要指標之一。我們對DAN片段遷移時間的重現(xiàn)性進行了考察，在優(yōu)化的實驗條件下，對所用的DNA相對分子質(zhì)量marker和PCR產(chǎn)物連續(xù)分析6次，并在待測試樣中加入Sulforhdamine B熒光試劑作為內(nèi)標物，采用相對遷移時間以消除進樣時間和電壓的波動對遷移時間的影響。在優(yōu)化的實驗條

件下，對所用的DNA marker分析具有很好的重現(xiàn)性，相對遷移時間的相對標準偏差0.90——1.5.對進口大豆的雙重PCR產(chǎn)物重復測定，其中125bp和142bp DNA段相對遷移時間分別是0.504和0.526,其相對標準偏差為2.O——3.2 .

2.毛細管電泳與瓊脂糖凝膠電泳的比較

將陽性抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆標準、空白對照和進口大豆的雙重PCR產(chǎn)物以及陰性非轉(zhuǎn)基因大豆的內(nèi)源基因PCR產(chǎn)物同時用毛細管電泳和瓊脂糖凝膠電泳進行了比較實驗，傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳結果可見，進口大豆和陽性對照的轉(zhuǎn)基因大豆標準均擴增出2個條帶，分別為125 bp和142 bp;作為陰性對照的非轉(zhuǎn)基因大豆僅能擴增出內(nèi)源基因的118 bp條帶;用無菌水作模板的空白對照不能擴增出任何條帶。比較瓊脂糖凝膠電泳與毛細管電泳的結果，兩者基本一致。

毛細管電泳采用上萬伏的高電壓，能更有效地分離差異較小的片段。并能在較短的時間內(nèi)完成分析。本實驗目標DNA段在15 min內(nèi)就可被分離，縮短了分析時問。而瓊脂糖凝膠電泳分離上述兩個片段需要50min.可見，同瓊脂糖凝膠電泳相比，毛細管電泳分析速度更快 毛細管電泳所需的樣品量少。本實驗采用電動進樣，進樣量約5nl,而瓊脂糖凝膠電泳需要5——10μl的上樣量 所以用毛細管進行分析，可以大大節(jié)約樣品用量，適合于痕量分析。

凝膠電泳圖譜的條帶一般較寬，不利于DNA段大小的確定。而毛細管電泳柱效高。峰形尖銳，鑒定能力強。本實驗采用內(nèi)標與樣品同時電泳，可減少進樣時間和電壓的波動等造成的實驗誤差，提高了結果的準確性。根據(jù)DNA Marker和樣品毛細管電泳圖譜，可得DNA段大小分別為124 bp和145 bp,與測序結果相比較。分別差1 bp和3 hp;圖中峰的DNA段大小為121bp,與文獻報道的片段大小相比僅差3 bp.由此可見。用毛細管電泳比用凝膠電泳確定DNA段大小更為準確。

綜上所述，本研究利用雙重PCR技術同時擴增抗草甘瞵轉(zhuǎn)基因大豆的3種外澡靶基因，只需一次PCR反應就可以準確鑒定出抗草甘膦大豆 采用激光誘導熒光-毛細管電泳分析PCR產(chǎn)物，較傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠電罰：相比，縮短了分析時間，分析靈敏度顯著提高，而且樣品用量少 本研究所建立的方法為食品中轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測提供了一個可靠的分析手段。