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上海雅吉生物科技有限公司
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細(xì)胞原代培養(yǎng)實驗之組織塊直接培養(yǎng)法
2019-9-18 閱讀(568)
實驗材料 孕鼠新生小鼠
試劑、試劑盒 RPMI1640培養(yǎng)基牛血清胰蛋白酶Hanks液酒精青霉素鏈霉素
儀器、耗材 培養(yǎng)瓶青霉素瓶廢液缸血球計數(shù)板蠟盤手術(shù)器械大頭針離心管小玻璃漏斗三角燒瓶平皿吸管試管移液管無菌紗布無菌眼科剪
實驗步驟
一、將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和浸入體內(nèi)）再用酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中。
二、用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。
三、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1 mm2），再用Hank's液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。
四、將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附與瓶底面。
五、翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。
六、于37℃靜置3-5小時，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng)。
收起
注意事項
1. 嚴(yán)格進(jìn)行動物皮膚消毒，使用三套器械取材。新生動物皮膚先用2%酒液消毒，成年鼠先用3%~5%酒液消毒后用75%酒精消毒。
2. 嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，防止細(xì)菌、霉菌、支原體污染，避免化學(xué)物質(zhì)污染。
3. 吸取液體前，瓶口和吸管進(jìn)行火焰消毒；吸取液體時，避免瓶口和吸管碰撞。
4. 離心管入臺前，管口、管壁應(yīng)消毒。
5. 實驗者離開超凈臺時，要隨時用肘部關(guān)閉工作窗。
6. 使用過的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一個器皿中繼續(xù)消毒，在浸泡器械時剪刀口要叉開放，鑷子彎頭要向下放，并加蓋消毒。
7. 器材使用時既要注意用火焰消毒，又要防止?fàn)C傷、燙死細(xì)胞。經(jīng)火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷卻。
8. 超凈臺內(nèi)溫度、濕度較大，在夏天工作時臺內(nèi)散熱更慢，因此進(jìn)行細(xì)胞懸液混勻、接種時，離火焰要稍微遠(yuǎn)些。
收起
其他
一、操作要領(lǐng)
1. 混勻操作要領(lǐng)
（1）火焰消毒吸管，用Hank's液冷卻和濕潤管內(nèi)壁（這是因為剛分離的組織細(xì)胞易粘在管壁上）。
（2）吸管頭插入管底。
（3）用吸管反復(fù)輕輕吹打組織塊。
2. 器械的使用
（1）用工作臺消毒鑷子取浸泡在酒精中消毒的器械。
（2）器械置無菌干紗布內(nèi)嚓一下。迅速通過火焰，冷卻后使用。
（3）用過的器械置另一加蓋的器皿中再消毒。
（4）器械按浸泡消毒的順序使用。
（5）各套再消毒器械不可混用。
3. 除去組織塊多余水分
用吸管將組織塊推向青霉素瓶一角，然后將有組織塊的瓶面翻向上方，吸去流向?qū)?cè)的多余水分。
注意：多余水分若不除去，會使組織塊剪切不細(xì)，消化后的細(xì)胞懸液清亮（細(xì)胞數(shù)少），并可見消化液中有線狀或絮狀物漂浮。
4. 細(xì)胞計數(shù)
（1）用吸管混勻待計數(shù)的細(xì)胞懸液。
（2）將一小滴細(xì)胞懸液從蓋玻片與載玻片交界部位滴入細(xì)胞計數(shù)池中。
（3）沉降1分鐘，低倍鏡下計數(shù)血球計數(shù)板四大中格的結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞，小細(xì)胞團(tuán)計數(shù)為1。
（4）計數(shù)時，如果細(xì)胞壓在格上，則數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。然后按下式計算出每毫升懸液中的細(xì)胞數(shù)。
（四大中格細(xì)胞數(shù)/4）*10 000=細(xì)胞數(shù)/毫升
