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產品及特點 飾紋汀蛙虹彩病毒(Boheliridovirus，BIV) 會引發(fā)虹彩病毒病，感染后主要是會
造成造血織組壞死，主要病征會出現(xiàn)體色變黑、出血的情況，傳染方式主要是以水平感
染為主，虹彩病毒病是一種全身性、系統(tǒng)性感染，在組織病理學變化方面，細胞腫大虹
彩病毒通常會導致病蛙的脾、腎等病毒靶器官內出現(xiàn)大量嗜堿性的、細胞質勻質化的、
直徑約 15 μm～20 μm 的腫大細胞，死亡率較高，對生態(tài)環(huán)境具有重大影響，因此飾
紋汀蛙虹彩病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了
簡單快捷的飾紋汀蛙虹彩病毒染料法熒光定量 PCR 檢測試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據飾紋汀蛙虹彩病毒保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4. 一管式熒光定量 PC
使用方法 一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬
不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，
本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對
照。
2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得
1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，
充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分
震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
8. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），
一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步制備的 PCR 陽性對照的第 4
號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝）或第 5 號（濃度為 1×10E5
拷貝/μL，10μL 相當于 10 萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求
的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，
則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。
9. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼
容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。本
試劑盒免費贈送 15 次一管式病毒 DNAout
三、設置 qPCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）
10. 如果只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個
樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于 PCR 陽性對照。如果做 2-3 次重復，則
反應設置數(shù)量相應增加 2 或 3 倍。
11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢
后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：
成分
樣品管
N+2 個
PCR 陰性
對照管
PCR 陽性
對照管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix
（棕色管）
10 μL 10 μL 各 10 μL
飾紋汀蛙虹彩病毒 PCR
引物混合液（白蓋）
2 μL 2 μL 各 2 μL
自備 10×ROX (見注) 2 μL 2 μL 各 2 μL
N+2 待測樣品 DNA 模板 6 μL 不加 不加
第 7 步所得 PCR 陽性對照
稀釋液（2-7 號）
不加 不加
各 6μL（2 號樣到
2 號管，3 號樣到 3
號管…）
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光 PCR 儀
器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene
3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。
12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據儀器不同而自行
優(yōu)化）。
過程 溫度 時間
預變性 95℃ 5 分鐘
PCR 反應
（30 個循環(huán)）
94℃ 60 秒
52℃ 60 秒
75℃ 60 秒
13. 數(shù)據采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合 DNA 時，
大吸收光譜在 471 nm，結合 DNA 時的大吸收光譜在 500 nm，大發(fā)射光
譜在 530 nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。
四、數(shù)據處理
14. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱
軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的
log 值，再推算出其濃度。
15. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等
于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于
30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為
陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則
為陰性，如果小于 40，則為陽性。
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