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上海雅吉生物科技有限公司
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PCR一般步驟
2019-9-20 閱讀(1236)
(一)總RNA提取
取液氮凍存腦組織置于玻璃勻漿器中，按100g:3ml的比例加入Trizol試劑，嚴格按照TrizolRNA提取試劑盒說明書的流程進行。
(1)加Trizol（按3ml/100mg組織，寧多勿少）置于玻璃勻漿器中勻漿后，冰浴10-15min。
(2)移入1.5mlEP管中，4ºC 13000g離心10min。
(3)上清液移至另一EP管中，室溫放置10-15min。
(4)加入0.2ml/1mlTrizol，振蕩15s，室溫置5min。
(5)4ºC 12000g離心15min。
(6)仔細吸取上層水相，移至新的EP管中。
(7)加入0.5ml異丙醇/1mlTrizol，振搖，置室溫10min。
(8)4ºC 12000g離心10min，EP管底部可見白色沉淀物。
(9)棄上清，紙巾吸干，加入75%乙醇1ml，振搖，充分洗滌沉淀。
(10)4ºC 11000g離心5min。
(11)吸盡乙醇，空氣干燥10min（可離心加快干燥，盡量吸盡離心液體）。
(12)半透明時將RNA溶于去核酸酶的水20ul中（可吹打混勻），-20ºC凍存?zhèn)溆谩?/p>
(13)所提取的總RNA用核酸蛋白分析儀分析RNA含量和純度，所有標本260/280nm吸光度的比值均為1.8-2.0。
(14)取所提取的總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳，顯示出清晰的28s和18s兩條rRNA。
(二)逆轉(zhuǎn)錄反應
DEPC水 9ul
dig primer 1ul
5×buffer 4ul
10M dNTPmix 2ul
RNA酶抑制劑 1ul
總RNA 2ul 70ºC 5min
**********************************************************
逆轉(zhuǎn)錄酶 1ul
**********************************************************
20ul 42ºC 60min(+?)
70ºC 10min
4ºC ∞
(三)PCR反應
DEPC水（可用高壓雙蒸水） 17.5ul
10×Taq buffer 2.5ul
MgCl2 2.0ul
10M dNTP Mix 0.5ul
上游引物 0.5ul
下游引物 0.5ul
Tap酶(5u/ul) 0.5ul
總CDNA 1.0ul
*********************************************************
25ul
PCR儀參數(shù)設置
94 ºC
5min 94 ºC ? ºC 72 ºC
30s 45s 45s 72ºC 4ºC
7min ∞
(四)電泳
(1)20ml 0.5×TBE
0.3-0.4g瓊脂糖
煮沸，配成1.5-2.0%瓊脂糖凝膠（RNA為1.0%）
(2)冷切至60 ºC，加入4ulEB，倒入槽中（8孔梳），室溫冷切30min
(3)拔梳，加入4ulPCR產(chǎn)物+1ul上樣緩沖液
(4)電壓100-135V
(5)UVP成像系統(tǒng)觀察
試劑配制
5×TBE配制方法（1L計）
Tris-Base 54g
硼酸 27.5g
EDTA 3.72g
加雙蒸水至1L
2%瓊脂糖凝膠配制方法
瓊脂糖 0.4g
0.5×TBE 20ml
EB 4ul
方法的改進版：室溫冷切10min，放至4ºC冰箱20min
相關(guān)技巧
1、注意反應體系的一致，可分裝
2、先P內(nèi)參，檢驗CDNA的完整性
3、首先考慮退火溫度
4、注意引物的設計
5、若目的條帶無法到達位置，可先或晚于MAKER電泳
6、通過加量或減量PCR產(chǎn)物來達到灰度的調(diào)整
7、必要時可行標本間替代
8、可設計相應大小的內(nèi)參來達到終目的
9、2度水浴箱的妙用
10、必要時進行相關(guān)技術(shù)處理
