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上海雅吉生物科技有限公司
主營產(chǎn)品： 培養(yǎng)原代細(xì)胞,細(xì)胞系價(jià)格,耐藥細(xì)胞株,實(shí)時(shí)熒光pcr試劑盒 |
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乙肝病毒（HBV）PCR檢測試劑盒
2019-9-20 閱讀(456)
實(shí)驗(yàn)方法原理 多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是一種模擬天然DNA復(fù)制過程，在體外擴(kuò)增特異性DNA（或RNA）片段的新技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)是將待檢雙鏈DNA經(jīng)94℃高溫變性成單鏈作模板，然后加入一對(duì)人工合成的寡核苷酸引物，引物分別與待擴(kuò)增DNA片段的兩端互補(bǔ)，經(jīng)55℃ 低溫退火，引物與模板互補(bǔ)結(jié)合。在72℃條件下，結(jié)合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反應(yīng)體系中的4種dNTP為原料，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式延伸合成兩條新的DNA鏈。所擴(kuò)增的DNA可作為下一輪擴(kuò)增反應(yīng)的模板。重復(fù)上述循環(huán)過程，經(jīng)過20～30個(gè)周期后，特異的目的DNA可擴(kuò)增百萬倍以上。 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后即可觀察到特異的擴(kuò)增條帶。
實(shí)驗(yàn)材料 血清樣品
試劑、試劑盒 HBV-PCR反應(yīng)液 HBV-DNA裂解液陽性模板溴化乙錠
儀器、耗材 PCR擴(kuò)增儀電泳儀紫外線分析儀
實(shí)驗(yàn)步驟
一、標(biāo)本處理
取混勻的血清20μl加20μl裂解液，攪勻后100℃沸水浴10分鐘，后15000rpm/min離心3分鐘，取4μl上清待檢。
二、加樣及PCR
取反應(yīng)液一管（使用前稍加離心），加4μl待檢上清或陽性對(duì)照于底層反應(yīng)液中，混勻后高速離心片刻，然后置PCR儀，設(shè)置程序94℃預(yù)變性2分鐘，再按94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/60秒擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。
三、電泳與結(jié)果判斷
取15μl 反應(yīng)液，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（5V/cm）30分鐘后，在紫外燈下觀察結(jié)果，若410bp處出現(xiàn)橙黃色帶，則HBV為陽性。
收起
注意事項(xiàng)
1. 反應(yīng)管中加好所有試劑后，應(yīng)立即上機(jī)擴(kuò)增，以免形成過多的二聚體。
2. 陽性模板可用陽性血清代替，處理方法同上。
3. 陽性模板及DNA提取液使用前需充分融化離心。
4. 反應(yīng)也的表面為固體封蓋劑，電泳取樣時(shí)從反應(yīng)管底部洗液。
5. EB為強(qiáng)致癌物，操作過程應(yīng)注意防護(hù)。
6. 注意無菌操作，以免出現(xiàn)假陽性。
