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上海雅吉生物科技有限公司
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足細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)節(jié)問題
2019-12-3 閱讀(3024)
小鼠腎小球足細(xì)胞細(xì)胞系 MPC5 購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心
培養(yǎng)基：RIPM 1640
2.1 足細(xì)胞復(fù)蘇與增值
取出凍存的足細(xì)胞株，迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的37℃水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化，約1-2 min 后凍存管內(nèi)液體*溶解，將細(xì)胞懸液移入盛有10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液的EP管中，在1000 r/min，離心4 min，然后棄上清，加入適量新鮮培養(yǎng)液（含10％FBS、100U/ml重組小鼠γ-INF 、和1%青-鏈雙抗的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液），輕輕吹混后將其接種于涂有I型膠原細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在5 % C02細(xì)胞孵箱中33℃恒溫培養(yǎng)，每兩天左右更換一次培養(yǎng)液。
細(xì)胞在33℃恒溫培養(yǎng)下處于增殖狀態(tài)，此時細(xì)胞胞體較小，足突樣結(jié)構(gòu)尚不明顯，細(xì)胞間排列較緊密，像鵝卵石樣平鋪，部分視野可見管腔樣結(jié)構(gòu)，當(dāng)細(xì)胞融合達到80％左右時即可進行傳代。（一般生長3天左右即可達到80%）。
2.2 足細(xì)胞傳代與分化
當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞增殖至80％左右融合時，將培養(yǎng)瓶的上清液倒棄，然后用PBS液輕輕洗滌三次后再加入2 ml 0.25％胰蛋白酶，放置于37℃培養(yǎng)箱中消化3 min作用，待細(xì)胞變圓，脫落，加入適量已配好的含10％FBS、1％青-鏈雙抗和無γ-INF的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液終止細(xì)胞消化，輕柔吹打細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入盛有10％ FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液的EP管中，在1000 r/min,離心5 min，棄上清后加入已配好的含10％ FBS和1％青-鏈雙抗的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液進行輕輕吹打，將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶中，于5％C02培養(yǎng)箱中在37℃恒溫下培養(yǎng)。
一般足細(xì)胞在37℃無γ-INF培養(yǎng)條件下處于分化狀態(tài)，此時足細(xì)胞呈多角形，胞體較透明，細(xì)胞間排列較疏松，管腔樣結(jié)構(gòu)明顯增多，生長速度有所減緩。 3天左右足細(xì)胞即停止增殖，1周左右有大量呈星型樣足細(xì)胞形成，此時可見足細(xì)胞的足突結(jié)構(gòu)很明顯，細(xì)胞間可見足突相互觸碰，到10天-14天時足細(xì)胞分化成熟。分化成熟的足細(xì)胞，為使細(xì)胞同步于G0期，一般在實驗前用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，然后再用于實驗。
2.3 足細(xì)胞計數(shù)
（1）用蘸有 75% 酒精的棉球?qū)⒓?xì)胞計數(shù)板擦拭干凈，自然晾干，然后在其一側(cè)蓋上蓋玻片。
（2）按上述方法用 0.25% 的胰蛋白酶消化需計數(shù)的足細(xì)胞，輕柔吹打使其形成足細(xì)胞懸液。
（3）用*頭吸出10μL細(xì)胞懸液滴至細(xì)胞計數(shù)板的蓋玻片一側(cè)邊緣處，使其充滿細(xì)胞計數(shù)板與蓋玻片之間的縫隙。
（4）在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞計數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)量并計數(shù)（遇到細(xì)胞壓線時只計數(shù)各方格線右側(cè)和下方的細(xì)胞）。
（5）運用以下公式估算待測細(xì)胞密度：細(xì)胞密度=（四大格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)/4）×104個/ml
2.4 足細(xì)胞凍存
細(xì)胞凍存前對 33℃足細(xì)胞進行常規(guī)換液。預(yù)先配制好細(xì)胞凍存液，按照 RPMI 1640 培養(yǎng)基：胎牛血清：二甲基亞砜（即 DMSO）=7:2:1 的比例，后置于 4℃冰箱預(yù)冷。凍存時，在細(xì)胞超凈臺中先按照上述方法消化 33℃足細(xì)胞，
使其形成均勻的細(xì)胞懸液，然后將其移入 15ml 離心管，以 1000 rpm 的條件離心10 min，離心結(jié)束后可見離心管底部有細(xì)胞沉淀，小心的倒掉上清液，并加入預(yù)冷后的凍存液，輕柔吹打混勻后將形成的混合液分裝至無菌的凍存管中（約1.5 ml）。再用記號筆于凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的稱、傳代次數(shù)、凍存者的姓名及凍存日期。將凍存管依次置于 4 度 1h、-20℃ 1h、-80℃過夜，后移入液氮灌中保存?zhèn)溆谩?/p>
