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上海雅吉生物科技有限公司
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軟瓊脂細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)
2019-12-9 閱讀(2926)
軟瓊脂細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)說明：
1）材料的準(zhǔn)備和配置：
1) 準(zhǔn)備2×基礎(chǔ)培養(yǎng)基：去離子水溶解1 g粉末培養(yǎng)基和0.2 g碳酸氫鈉，終體積為50 ml，0.2 μm濾器過濾除菌。
1) 在100 ml去離子水中加入1 g的瓊脂，配制1%的瓊脂。在100 ml去離子水中加入0.6 g的瓊脂制備0.6%的瓊脂。高壓滅菌瓊脂溶液，可儲(chǔ)存在4°C，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)再次加熱到瓊脂*溶解為止。
.2. 鋪下層瓊脂
1) 松開1%軟瓊脂的瓶蓋，微波加熱1-2 min，密切關(guān)注以防沸騰。繼續(xù)加熱，不時(shí)攪拌以混合，直到瓊脂*溶解至澄清。
2) 把融化的瓊脂溶液和預(yù)熱的2×培養(yǎng)基放在42°C水浴鍋。6孔板每孔需要1.5 ml的瓊脂與培養(yǎng)基的混合物。為了保證足量的混合物，每個(gè)6孔板準(zhǔn)備12 ml混合物。首先加6 ml培養(yǎng)基到50 ml離心管中，再加6 ml的1%瓊脂溶液。顛倒離心管幾次以混勻，動(dòng)作輕快以防軟瓊脂過早凝固。
3) 5 ml血清移液管每孔加1.5 ml混合物，避免氣泡沉在底部。
4) 蓋上板蓋，室溫凝固30 min。
3. 鋪含有細(xì)胞的上層瓊脂
1) 下層瓊脂凝固后，開始準(zhǔn)備上層瓊脂。首先，胰酶消化收集細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)，制備細(xì)胞懸液。按1000, 3000, 5000個(gè)細(xì)胞/ml制備細(xì)胞懸液(使用2×*培養(yǎng)基配置，每孔需0.75 ml細(xì)胞懸液和0.75 ml瓊脂，共1.5 ml)。每孔按1.5 ml體積算，需要準(zhǔn)備12 ml的細(xì)胞懸液。
2) 微波加熱0.6%瓊脂，把融化的瓊脂溶液和3.3步驟制備的細(xì)胞懸液放在42°C水浴鍋。
3) 按1：1比例混合0.6% 瓊脂和細(xì)胞懸液，每個(gè)6孔板需要12 ml混合液。每孔1.5 ml。轉(zhuǎn)移6 ml細(xì)胞懸液到50 ml離心管中。然后加6 ml 0.6%的瓊脂。注意：混合液溫度要保持42℃，避免凝固。
4) 動(dòng)作迅速，用移液管吹打2-3次混勻混合液，然后用5 ml的血清移液管吸取5.5 ml的混合物。每孔加1.5 ml混合物，避免氣泡沉在底部。
5) 細(xì)胞/瓊脂混合物室溫凝固30分鐘，然后放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。足夠的菌落形成所需時(shí)間因每個(gè)細(xì)胞系而異，通常為21 d左右（本實(shí)驗(yàn)周期為14 d）。
6) 瓊脂上層應(yīng)保持一層生長(zhǎng)培養(yǎng)基，以防止干燥。每星期加兩次100 μl的培養(yǎng)基。
4. 平板染色和菌落計(jì)數(shù)
1) 每孔加200 μl結(jié)晶紫染色15-20 min。
2) 菌落染色后，用成像儀拍攝照片并用圖像分析軟件計(jì)算菌落數(shù)。
