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主要用途
組織樣品細胞色素c氧化酶活性測定試劑是一種旨在通過細胞色素c氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)中還原性細胞色素c氧化后吸光峰值的降低，即采用比色法測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織（動物、人體、昆蟲等）裂解懸液中細胞色素c氧化酶的活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景
細胞色素c氧化酶（Cytochrome c oxidase）存在于真核生物的細胞線粒體上，主要通過氧化磷酸化為細胞提供能量?；诘孜镞€原型細胞色素c（reduced cytochrome c），受到細胞色素c氧化酶的催化，轉(zhuǎn)化為氧化型細胞色素c（oxidized cytochrome c），在分光光度儀下，出現(xiàn)吸光值的變化（550nm 波長），由此定量測定細胞色素c氧化酶的活性。細胞色素c氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容
 清理液（Reagent A）          60毫升
 裂解液（Reagent B）          10毫升
 緩沖液（Reagent C）          20毫升
 反應(yīng)液（Reagent D）           2毫升
 稀釋液（Reagent E）          1毫升
 穩(wěn)定液A（Reagent F1）          1管
 穩(wěn)定液B（Reagent F2）        250微升
產(chǎn)品說明書            1份

保存方式
保存清理液（Reagent A）、 緩沖液（Reagent C）和 稀釋液（Reagent E）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里； 反應(yīng)液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備
1.5毫升離心管：用于反應(yīng)液和樣品制備的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
（微型）臺式離心機：用于樣品操作
比色皿：用于比色的容器
分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟
一、樣品準備
1．手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定組織重量
2．（選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3．（選擇步驟）加入適量的（500毫克組織需要3毫升） 清理液（Reagent A）清洗1次
4．移入到一個液氮凍存管
5．即刻放進液氮罐過夜
6．次日從液氮罐里取出，即刻（z快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
7．放進一個15毫升錐形離心管
8．加入預(yù)冷的500微升 裂解液（Reagent B）
9．轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
10．強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
11．置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆茫?br />12．放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM）
13．小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
14．移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  考馬斯亮藍蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒A045-2）
15．即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
 
二、測讀準備
1．準備好待測樣品，置于冰槽里融化
2．設(shè)定好分光光度儀：溫度25℃，波長550nm，間隔10秒，測讀7次（共60秒），并置零或設(shè)置0秒和60秒各測讀1次
3．實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 穩(wěn)定液B（Reagent F2）置入冰槽里融化，然后移出250微升到 穩(wěn)定液A（Reagent F1）管里，混勻后，標記為 穩(wěn)定工作液，置于冰槽里備用（注意，用完后即刻放回－20℃冰箱里）。然后將－20℃冰箱里的試劑盒中的 反應(yīng)液（Reagent D）置入冰槽里融化，然后移出100微升到新的1.5毫升離心管，加入3微升 穩(wěn)定工作液，輕柔混勻后，室溫下避光靜置至少15分鐘（可見顏色變化），置于冰槽里，標記為 反應(yīng)工作液（注意：參見注意事項4），放在暗室里備用。然后進行下列操作
4．緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、背景對照測定
1．移取800微升 緩沖液（Reagent C）到新的1毫升比色皿
2．加入100微升 稀釋液（Reagent E）
3．上下傾倒數(shù)次，混勻
4．室溫下孵育3分鐘
5．放進分光光度儀，置零
6．取出比色皿，加入100微升含有 反應(yīng)液（Reagent D）和 穩(wěn)定液（Reagent F）的 反應(yīng)工作液
7．上下傾倒數(shù)次，混勻
8．即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0秒讀數(shù)－60秒讀數(shù)），正常讀數(shù)差值為0.001至0.005

四、樣品測定
1．移取800微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入100微升待測樣品（注意：建議總量50微克總蛋白，且樣品需澄清）
3．上下傾倒數(shù)次，混勻
4．室溫下孵育3分鐘
5．放進分光光度儀，置零
6．取出比色皿，加入100微升含有 反應(yīng)液（Reagent D）和 穩(wěn)定液（Reagent F）的 反應(yīng)工作液
7．即刻上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8．即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0秒讀數(shù)－60秒讀數(shù)），通常活性讀數(shù)差值為正數(shù)

五、計算樣品活性
【（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）×1（體系容量；毫升）×樣品稀釋倍數(shù)】÷【0.1（樣品容量；毫升）×21.84（毫摩爾吸光系數(shù)×1（反應(yīng)時間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾細胞色素c/分鐘

注意事項
1．本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
2．操作時，須戴手套
3．樣品制備中忌用DTT和巰基乙醇等處理
4．每增加1個樣品，增加 反應(yīng)工作液為： 反應(yīng)液（Reagent D）100微升＋ 穩(wěn)定工作液3微升，以此類推。配制反應(yīng)工作液時，須根據(jù)樣本數(shù)量配制實際工作液容量。
5．系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
6．分光光度計波長嚴格設(shè)置在550nm，誤差10nm將不產(chǎn)生信號
7．加樣后3秒內(nèi)進行比色測定
8．比色測定后，比色皿須清洗*
9．比色皿背景空對照0秒讀數(shù)通常大于0.2為理想狀態(tài)；建議使用比色皿測定
10．背景空對照的正常讀數(shù)差值（0秒－60秒）通常為0.001至0.005（正負即可）
11．樣品0秒讀數(shù)通常和背景空對照0秒讀數(shù)一致
12．樣本測定60秒讀數(shù)低于0秒讀數(shù)表明具有酶活性
13．酶活性單位濃度定義：在25℃室溫下，pH 7.0的情況下，每單位酶在單位時間內(nèi)（每分鐘）氧化1微摩爾的細胞色素c
14．建議待測樣本總蛋白濃度為50微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，即60秒讀數(shù)不變或為零，則可以增加或降低樣本量（本公司提供考馬斯亮藍蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒A045-2）