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上海雅吉生物科技有限公司
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抗體及其純化方式介紹
2021-1-15 閱讀(1247)
IgG即免疫球蛋白G的縮寫，本期先為大家介紹這位住在您身體的老朋友。
IgG分子的結(jié)構(gòu)如下圖所示，它由兩條重鏈和兩條分子量較小的輕鏈組成的個四肽，并且呈現(xiàn)為Y字型的結(jié)構(gòu)，各個鏈之間由二硫鍵進行連接，分子量大約為150kDa， IgG 分子是血液中含量很高的種糖蛋白，在正常人血液中，幾乎所有 IgG 的Fc部分都含有至少兩個保守的 N- 糖基化位點。
此外，部分抗體的Fab上存在 N- 糖基化位點。人lgG可分為四個亞類，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，它們之間的區(qū)別是鉸鏈區(qū)氨基酸的組成以及重鏈二硫鍵的數(shù)量和位置的不同。隨著研究的不斷深入，抗體片段應用也非常廣泛，如單鏈抗體ScFv在抗體藥中的應用。
IgG作為機體的免疫衛(wèi)士，主要在機體免疫中起保護作用，對抗大部分的細菌和病毒，IgG是唯能通過胎盤的免疫球蛋白，IgG能夠激活補體系統(tǒng)，參與抗體介導的細胞毒性即ADCC作用，同時參與部分超敏反應。那么如何才能夠?qū)gG進行高效的純化呢？天為您介紹種非常成熟的的純化方法，即Protein A和Protein G純化IgG。
1. Protein A
20世紀中期，Jensen發(fā)現(xiàn)有種蛋白可以與人和兔血清抗體廣泛結(jié)合，該蛋白于1964年次被稱為Protein A。 Protein A是種金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白質(zhì)，分子量42KD，它能夠特異性地結(jié)合多種免疫球蛋白的Fc區(qū)段而與Fab區(qū)或輕鏈結(jié)合很弱。天然的Protein A有5個IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域和未知功能的非Fc結(jié)合域，結(jié)構(gòu)示意圖如下：
此結(jié)構(gòu)的蛋白A大量結(jié)合IgG的同時，其非Fc結(jié)合域能結(jié)合部分雜蛋白，導致洗脫下來的IgG純度不夠，因此科學家利用基因工程的方法克隆Protein A的基因并進行改造，得到重組型蛋白A，其非特異性結(jié)合明顯降低。下圖展示重組蛋白A的偶聯(lián)方式和載量：
重組蛋白A將蛋白A抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域進行保留，分子量變?yōu)?5KD，末端經(jīng)過改造后加上個C端的半胱氨酸，利用環(huán)氧活化的方式單點偶聯(lián)到瓊脂糖上，降低空間位阻的同時提高IgG的結(jié)合能力。步親和層析后樣品純度可超過90%。重組蛋白A的5個結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，其中B位點的結(jié)合能力更強，因此構(gòu)建了新的Sure配基，將其中不耐堿的氨基酸進行了改造，因此Sure配給耐堿性更強，且載量更高。
2. Protein G
蛋白Ｇ來自于鏈球菌Ｇ族的細胞表面蛋白，是III型Fc受體，分子量為25KD，其通過類似于蛋白A的非免疫機制而結(jié)合抗體的Fc段，蛋白G與蛋白A均可結(jié)合抗體的Fc段，不同的是，蛋白G還能結(jié)合Fab段，且蛋白G可以更廣泛的結(jié)合更多類型的IgG分子，多克隆IgG分子，同時蛋白G與血清蛋白結(jié)合水平低，產(chǎn)物純度高，且配基脫落更低?？贵w基本結(jié)構(gòu)和蛋白A/G的結(jié)合位點如下圖所示：
蛋白G可以純化不能與蛋白A結(jié)合的哺乳動物抗體。重組型的蛋白G經(jīng)改造后已經(jīng)去除了白蛋白結(jié)合位點（血清白蛋白是抗體來源的主要污染物）及細胞表面結(jié)合位點，減少了非特異性結(jié)合。
3. Protein A 和Ｇ親和力對比
蛋白A和蛋白G對于不同種屬和不同亞型的抗體結(jié)合能力差異如下表所示，蛋白A對兔來源抗體的親和力較高，蛋白G對于小鼠等部分哺乳動物抗體的親和力較高。
現(xiàn)在對于蛋白Ａ和蛋白Ｇ，您是否有了更深入的認識呢？其實我們還有多種抗體親和材料供選，適合于捕捉各種抗體片段的CaptoＬ，以及有更好耐堿性的MabSelect SuRe，以及高載量高性能的MabSelect PrismA。
● MabSelect Xtra 填料是目動態(tài)載量高的不耐堿的抗體純化填料
● MabSelect SuRe 填料可用NaOH 做在位清洗，有效降低清洗成本
● MabSelect SuRe LX填料可用NaOH在位清洗，動態(tài)載量高，達60mg人IgG/ml
● MabSelect PrismA填料可使用1.0M的NaOH在位清洗，動態(tài)載量高，可達80mg人IgG/ml
來張圖看看咱們這些高載量的產(chǎn)品吧！下圖橫坐標為停留時間，MabSelect™ PrismA能夠在6分鐘停留時間內(nèi)結(jié)合80g mAb/L填料，在4分鐘停留時間內(nèi)結(jié)合65g mAb/L填料。
再來比較下幾種填料的耐堿性能。在150個運行周期期間，使用1.0M NaOH清洗后，MabSelect™ PrismA仍保留超過90%的動態(tài)結(jié)合載量。
更高的耐堿性意味著柱子擁有更長的使用周期，且實驗的重復性能夠得到很好的保障，載量如此高的層析填料，是否打動您了呢？
