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細胞凋亡（TUNEL，TUNEL染色）檢測技術簡介
2021-2-23 閱讀(16520)
細胞凋亡是指為維持內環(huán)境穩(wěn)定，生物體內細胞在特定的內源或外源信號誘導下，其死亡途徑被激活，并在有關基因的調控下發(fā)生的程序性死亡過程。細胞凋亡是程序性死亡過程的一種主要形式，它涉及染色質凝聚和外周化、細胞質減少、核片段化、細胞質致密化、與周圍細胞中斷、內質網(wǎng)與細胞膜融合，終細胞片段化形成許多細胞凋亡體。
細胞凋亡用（TUNEL，TUNEL染色）（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細胞凋亡檢測試劑盒來檢測。細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況。細胞凋亡檢測其原理是熒光素標記的12-dUTP在末端脫氧核苷轉移酶(TdT)的作用下，連接到凋亡細胞中斷裂的DNA的3’-OH末端，利用由熒光顯微鏡或者流式細胞檢測儀檢測凋亡的發(fā)生。
細胞凋亡與壞死是兩種*不同的細胞凋亡形式，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用，它并不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現(xiàn)象，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起著必要的作用。它在生物體的進化、內環(huán)境的穩(wěn)定以及多個系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。細胞凋亡不僅是一種特殊的細胞死亡類型，而且具有重要的生物學意義及復雜的分子生物學機制。凋亡是多基因嚴格控制的過程。
根據(jù)死亡細胞在形態(tài)學、生物化學和分子生物學上的差別，可以將二者區(qū)別開來。細胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹幾種常用的測定方法。
一、細胞凋亡的形態(tài)學檢測
根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征，人們已經(jīng)設計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學檢測方法。
1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡檢測細胞凋亡：
（1） 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。
（2） 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。
2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡拍細（胞凋亡）結果：
一般以細胞核染色質的形態(tài)學改變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡的進展情況。
常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與 DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。
Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。
DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。
結果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態(tài)學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。
3 透射電子顯微鏡觀察|細胞凋亡：
結果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。細胞凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結構；細胞凋亡Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。
二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）檢測|細胞凋亡：
Annexin V/PI雙染檢測|細胞凋亡：
磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。因此 Annexin V 被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。
Annexin V/PI檢測|細胞凋亡|優(yōu)勢：和其他凋亡檢測方法相比，Annexin V/PI雙染可以輕松區(qū)分細胞凋亡和壞死，并在凋亡早期進行檢測，靈敏度高。
