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組織總磷含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
 微量法 100T/96S
注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
磷的存在形態(tài)包括無(wú)機(jī)磷與有機(jī)磷。無(wú)機(jī)磷主要指磷酸根，參與生物體內(nèi)多種代謝，包括能
量代謝、核酸代謝、蛋白質(zhì)磷酸化和脫磷酸化等。通過(guò)測(cè)定總磷與無(wú)機(jī)磷含量即可了解作物
對(duì)磷的利用率，進(jìn)而為合理施肥提供依據(jù)。
測(cè)定原理：
總磷經(jīng)消化后，轉(zhuǎn)化成無(wú)機(jī)磷。鉬藍(lán)法是測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量的經(jīng)典方法，一定條件下，鉬藍(lán)與
磷酸根生成 660nm 有特征吸收峰的物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定 660nm 光吸收，即可計(jì)算無(wú)機(jī)磷含
量，進(jìn)而可計(jì)算出組織中總磷含量。
自備儀器和用品：
離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾
水和濃硫酸。
試劑組成和配置：
試劑一：液體×1 瓶，4℃保存（強(qiáng)腐蝕性，強(qiáng)氧化性）。
試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前配制，加入 7.5mL 蒸餾水，溶解后再加入 5mL
試劑二，混勻。
標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1 支，20μmol/L 無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)液，－20℃保存。
有機(jī)磷消化：
取帶蓋試管，加入精確稱取的約 0.1g 組織，加濃硫酸 1 mL，蓋緊（防止水分散失）后沸水
浴 10min 左右，待溶液呈黑色或棕色時(shí)取出。稍冷后，加試劑一 200μL，充分混勻，蓋緊后
繼續(xù)沸水浴，直到溶液呈透明狀，取出室溫冷卻后，加蒸餾水 8.8 mL，充分混勻；室溫，
8000g，離心 10min，取上清液待測(cè)。
測(cè)定：
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 660 nm，蒸餾水調(diào)零。
2.打開(kāi)水浴鍋，調(diào)節(jié)溫度到 40℃。
3. 空白管：取 0.5mL EP 管，依次加入 100μL 蒸餾水，100μL 試劑三，混勻后置于 40℃水
浴保溫 10min，室溫冷卻 10 min 后于 660 nm 測(cè)定吸光度，記為 A 空白管。
4. 標(biāo)準(zhǔn)管：取 0.5mL EP 管，依次加入 10μL 標(biāo)準(zhǔn)液，90μL 蒸餾水，100μL 試劑三，混勻后
置于 40℃水浴保溫 10min，室溫冷卻 10 min 后于 660 nm 測(cè)定吸光度，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。
5. 測(cè)定管：取 0.5mL EP 管，依次加入 10μL 上清液，90μL 蒸餾水，100μL 試劑三，混勻后
置于 40℃水浴保溫 10min，室溫冷卻 10 min 后于 660 nm 測(cè)定吸光度，記為 A 測(cè)定管。
組織總磷含量計(jì)算：
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1） 按照蛋白含量計(jì)算
總磷含量(mmol/mg prot) = [C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]×V 總
÷Cpr
= 1×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷W
（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
總磷含量(mmol/g )= [C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]×V 總÷W

= 1×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷W
C 標(biāo)準(zhǔn)液：1 mmol/L；V 總：上清液總體積，10 mL=0.01 L；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；
W：樣品質(zhì)量，g。
b.使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：
（1）按照蛋白含量計(jì)算
總磷含量(mmol/mg prot) = [C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]×V 總
÷Cpr
= 1×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷W
（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
總磷含量(mmol/g )= [C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]×V 總÷W
= 1×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷W
C 標(biāo)準(zhǔn)液：1 mmol/L；V 總：上清液總體積，10 mL=0.01 L；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；
W：樣品質(zhì)量，g。
注意事項(xiàng)：
1. 試劑三需臨用前配制，并且當(dāng)天使用完畢。
2. 40min 內(nèi)完成比色。
3. 低檢出限為 10μ mol/L。