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描述：

初級內(nèi)體（EE）是次級成熟內(nèi)體的起點(diǎn)，   初級內(nèi)體主要是由內(nèi)吞的囊泡相互融合形成。初級內(nèi)體不僅僅 通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的信號通路接受胞吞物，還有其他許多通路。胞吞機(jī)制除了在維持正常細(xì)胞生理中起到重 要作用，還在阿爾茲海默病和遺傳性溶酶體儲積癥等許多疾病中發(fā)揮了很大作用。傳統(tǒng)分離內(nèi)體的方法是采 用密度梯度超速離心法，   需要大量起始原材料， 方法繁瑣費(fèi)時(shí)。  Minute TM 內(nèi)體分離試劑盒基于離心管柱法，  快速簡單，  僅需要少量的培養(yǎng)細(xì)胞或者毫克級的組織樣品。   本試劑盒可以從培養(yǎng)的細(xì)胞和組織樣品中大量沉 淀富集初級內(nèi)體， 有助于該領(lǐng)域的研究。

試劑盒組分

1.  緩沖液 A    15ml

2.  緩沖液 B    15ml

3. 2 根塑料研磨棒

4. 20 個(gè)離心管柱

5. 20 個(gè)收集管

6.  組織分離粉  2.5 克

所需附加材料

1XPBS
渦旋震蕩儀
臺式離心機(jī)

儲存：
儲存于 4oC

重要產(chǎn)品信息

1.  仔細(xì)閱讀整個(gè)操作說明。 將離心管柱和接收管套管放置于冰上預(yù)冷。

2.  所有離心步驟都需要在 4 oC 室溫下或者低溫離心機(jī)中進(jìn)行。

3.  研究蛋白磷酸化，  磷酸酶抑制劑應(yīng)在使用前加入緩沖液 A 中。蛋白酶抑制劑可以選擇添加或不添加， 如添加在使用前加入緩沖液 A 中。

4.  推薦使用 BCA 試劑盒用于蛋白濃度測定

操作方法：

1.   將離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷。
2. 培養(yǎng)的細(xì)胞樣品。 低速離心 （500-600xg， 5 分鐘）  收集 10-30 X 106 細(xì)胞， 接第 3a 步。  組織樣品接第 3b 步。
3. 3a.  用預(yù)冷的 PBS 清洗細(xì)胞，  *去除上清，  加 500ul 緩沖液 A 將細(xì)胞重懸，  并放置于冰上孵育5- 10 分鐘，   大力渦旋振蕩 10-30 秒，立即將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管柱中，接第 4 步。
3b.  組織樣品。  將 10-20mg 組織樣品（新鮮或冷凍）  放置于離心管柱上，   加 200ul 緩沖液 A，用 塑料棒反復(fù)擠壓扭轉(zhuǎn)研磨 1 分鐘。（注：如果樣品是骨骼肌和心肌，  建議在研磨時(shí)添加 80- 100mg 組織分離粉到離心管柱上）再加入 300ul 緩沖液 A 到離心柱里，用移液器上下吹打幾次， 開蓋冰上孵育 5 分鐘，接第 4 步。
注意： 一些未均質(zhì)組織的存在不會影響樣品的質(zhì)量。塑料棒可以重復(fù)使用，用 70%的酒精清洗即可。
4.  蓋上蓋子，   16000xg 離心 30 秒  （建議使用可在 10s 內(nèi)升至 16000Xg 的臺式離心機(jī)）。離心后可將收集管中的樣品重懸，再過一次柱子以增加最終內(nèi)體的產(chǎn)量。
5.   棄去離心管柱，  將收集管的液體渦旋振蕩混勻 10 秒，  700xg 離心 2-3 分鐘  （沉淀為完整的細(xì)胞核和一些未破裂的細(xì)胞）
6. 將上清轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的 1.5ml 離心管中，   16000xg， 4oC 離心 30-60 分鐘（延長離心時(shí)間可以提高 純度）。離心后，再次將上清轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的 1.5ml 離心管中  （沉淀為大的細(xì)胞器和質(zhì)膜）。
7.  估算管中溶液體積，   加入一半體積的緩沖液 B,振蕩混勻 （樣品與緩沖液 B 的比例為 2：1， 也可以根據(jù)最終內(nèi)體得率按照 0.25：1 或者 1：1 減少或增加緩沖液 B 的量）  4oC 孵育 1h 或過夜（延 長時(shí)間可以增加產(chǎn)量）。
8.10000xg， 4oC 離心 30 分鐘， 棄掉上清 （上清是胞漿組分， 可選擇保留） ， 沉淀即是內(nèi)體。產(chǎn) 量通常在 20- 100ug 每個(gè)樣品。  內(nèi)體可以根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)選擇任何溶解液重懸溶解。推薦使用下 表中 MinuteTM 系列溶解液溶解內(nèi)體蛋白。

推薦按照下游實(shí)驗(yàn)應(yīng)用選擇以下蛋白溶解液