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植物過氧化物酶(POD)檢測試劑盒(愈創(chuàng)木酚微板法)的注意事項
2023-12-20 閱讀(998)
植物過氧化物酶(POD)檢測試劑盒(愈創(chuàng)木酚微板法)的注意事項
產品簡介：
過氧化物酶(peroxisome，POD)是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶，主要存在于細胞的過氧化物酶體中，以鐵卟啉為輔基，可催化過氧化氫，氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用，該酶屬于細胞木質素合成途徑中間的關鍵酶，研究該酶可以探討多種生物細胞發(fā)育過程中木質素沉積的代謝機理，為減少水果石細胞含量提高其品質提供依據。植物過氧化物酶(POD)檢測試劑盒(愈創(chuàng)木酚微板法)檢測原理是以愈創(chuàng)木酚(又稱 2-甲氧基酚)作為底物，在酶促反應的最適條件下采用每隔一定時間測定產物生成量的方法，于酶標儀 470nm 處測定吸光度，以吸光度變化所需酶量進行計算，主要用于植物組織的裂解液或勻漿液、血清等樣品中內源性的過氧化物酶活性，尤其適用于測定水果中過氧化物酶活性。該試劑盒僅用于科研領域，不適用于臨床診斷或其他用途。
自備材料：
1、蒸餾水
2、研缽或勻漿器
3、離心管
4、低溫離心機
5、水浴鍋或恒溫箱
6、96 孔板、酶標儀
操作步驟(僅供參考)：
1、準備樣品：
①植物樣品：取 0.5-1.0g 植物組織或水果中層果肉加入 4ml 預冷的 POD Lysis Buffer
研磨或勻漿，4℃ 10000g 離心 15~20min，留取上清液，即為 POD 粗提液，-20℃凍
存，用于過氧化物酶的測定。
②血漿、血清和尿液樣品：血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于該試劑盒的測定，-20℃凍存，用于過氧化物酶的測定。
③細胞或組織樣品：取恰當細胞或組織裂解液，如有必要用 POD Lysis Buffer 進行適當勻漿，4℃ 10000g 離心 15~20min，留取上清液，即為 POD 粗提液，-20℃凍存，用于過氧化物酶的測定。
④高活性樣品：如果樣品中含有較高活性的過氧化物酶，可以使用 POD Lysis Buffer 進行恰當的稀釋。
2、配制 POD Assay Buffer 工作液：取適量的 POD 氧化劑和 POD Assay Buffer，按 POD氧化劑：POD Assay Buffer=1：14 混合，即為 POD Assay Buffer 工作液，即配即用，不宜久置。
3、POD 加樣：取 96 孔板，按照下表設置對照孔孔、測定孔，注意：對照孔、測定孔中為同一待測樣品，但對照孔中是提前加熱煮沸 5min 的樣品；溶液應按照順序依次加入，并注意避免產生氣泡，如果樣品中的 POD 活性過高，可以減少樣品用量或適當稀釋后再進行測定，樣品的檢測最好能設置 2 平行孔，求平均值。
4、POD 測定：立即以酶標儀，以對照孔為對照，測定 470nm 處測定孔的吸光度(A 測定 0)；
37℃準確孵育 3min 后，立即加入 5μl POD 終止液終止反應(備選方案)，以對照孔為對
照，以酶標儀測定 470nm 處測定孔的吸光度(A 測定 1)。注意：加入 POD 終止液終止反
應不是必須步驟，可 37℃準確孵育 3min 后，以對照孔為對照，直接以酶標儀測470nm 處測定孔的吸光度(A 測定 1)。
計算：
POD 活性單位的定義：在該實驗條件下，每 1min 吸光度變化 0.01 所需酶量為一個活
性單位。
組織樣本 POD(U)={(A 測定 1-A 測定 0)×VT}/(W×VS×0.01×t)
式中：A 測定 1=孵育 3min 后測定孔的吸光度值
A 測定 0=加入 POD Assay buffer 工作液后測定孔的吸光度值
W=組織樣本的重量(g)
VT=提取酶液的總體積(ml)
VS=測定時所用酶液體積(ml)
t=反應時間
液體樣本 POD(U)=(A 測定 1-A 測定 0)/(0.01×t)
式中：A 測定 1=孵育 3min 后測定孔的吸光度值
A 測定 0=加入 POD Assay buffer 工作液后立即測定的測定孔吸光度值
t=反應時間
注意事項：
1、 待測樣品中不能含有酶抑制劑，同時需避免反復凍融。
2、 POD 酶液提取時，注意低溫操作，防止酶活性。
3、 以煮沸的酶液為對照時，酶要充分失活。
4、 POD 氧化劑和 POD 終止液具有一定腐蝕性，請小心操作。
5、 POD 氧化劑易揮發(fā)，請密閉保存，否則檢測效率下降。
6、 如果沒有酶標儀，也可以使用普通的分光光度計測定，每次檢測指標不宜過多，否則操作時間不一，有可能導致樣本間的差異。
7、 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
有效期：6 個月有效；常溫運輸，4℃保存。
植物過氧化物酶(POD)檢測試劑盒(愈創(chuàng)木酚微板法)的注意事項
