對于許多免疫組織化學(xué)（IHC）應(yīng)用，傳統(tǒng)的酶促擴(kuò)增程序足以實(shí)現(xiàn)足夠的抗原檢測。但是，有幾個(gè)因素限制了這些過程的敏感性和實(shí)用性。乙酰胺信號(hào)放大（TSA）已被證明是一種特別通用且功能強(qiáng)大的酶放大技術(shù)，具有更高的測定靈敏度。TSA基于HRP在低濃度過氧化氫存在下將標(biāo)記的含酪胺底物轉(zhuǎn)化為可與HRP或附近的laoansuan殘基共價(jià)結(jié)合的氧化的高反應(yīng)性自由基的能力。為了實(shí)現(xiàn)zui大程度的IHC檢測，酪胺預(yù)先標(biāo)記有熒光團(tuán)。通過每個(gè)過氧化物酶標(biāo)記的多個(gè)酪酰胺底物的更新而產(chǎn)生的信號(hào)放大轉(zhuǎn)化為低豐度靶標(biāo)的超靈敏檢測以及使用更少量的抗體和雜交探針。在免疫組織化學(xué)應(yīng)用中，源自TSA方法的靈敏度增強(qiáng)可以增加一抗稀釋度以減少非特異性背景信號(hào)，并且可以克服由于次優(yōu)固定程序或目標(biāo)表達(dá)水平低而導(dǎo)致的免疫標(biāo)記弱的問題。iFluor™488酪酰胺包含非常明亮和耐光的iFluor™488，可以使用標(biāo)準(zhǔn)FITC過濾器套件輕松檢測到。從TSA方法獲得的靈敏度增強(qiáng)允許增加一抗稀釋度以減少非特異性背景信號(hào)，并且可以克服由于次優(yōu)固定程序或靶標(biāo)表達(dá)水平低而導(dǎo)致的弱免疫標(biāo)記。iFluor™488酪酰胺包含非常明亮和耐光的iFluor™488，可以使用標(biāo)準(zhǔn)FITC過濾器套件輕松檢測到。從TSA方法獲得的靈敏度增強(qiáng)允許增加一抗稀釋度以減少非特異性背景信號(hào)，并且可以克服由于次優(yōu)固定程序或靶標(biāo)表達(dá)水平低而引起的免疫標(biāo)記薄弱的問題。iFluor™488酪酰胺包含非常明亮和耐光的iFluor™488，可以使用標(biāo)準(zhǔn)FITC過濾器套件輕松檢測到。

平臺(tái)

1. 修復(fù)/透化/阻斷細(xì)胞或組織

2. 在封閉緩沖液中添加一抗

3. 加入結(jié)合HRP的二抗

4. 準(zhǔn)備酪酰胺工作溶液，并在室溫下在細(xì)胞或組織中涂抹5-10分鐘

儲(chǔ)備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

乙酰胺儲(chǔ)備溶液（200X）：
將100 µL DMSO加入小瓶中并充分混合。注意：未使用的乙酰胺儲(chǔ)備溶液可在2-8 ^o C下儲(chǔ)存。

準(zhǔn)備工作溶液

酪酰胺工作溶液（1X）：
將100 µL酪酰胺儲(chǔ)備溶液添加到您選擇的20 mL含有0.003％H ₂ O ₂的緩沖液中。 注意：可以使用pH = 7.4的Tris Buffer以獲得*性能。注意：應(yīng)立即使用Tyramide工作溶液，并在使用當(dāng)天變新鮮。注意： 20 mL溶液適合200次測試。

程序

該方案適用于細(xì)胞和組織染色。

細(xì)胞固定和通透性

1. 在室溫下用3.7％甲醛或低聚甲醛的PBS固定細(xì)胞或組織20分鐘。
   

2. 用PBS沖洗細(xì)胞或組織兩次。
   

3. 在室溫下用0.1％Triton X-100溶液透化細(xì)胞1-5分鐘。
   

4. 用PBS沖洗細(xì)胞或組織兩次。

組織固定，脫石蠟和補(bǔ)液

過氧化物酶標(biāo)記

1. 可選：通過在過氧化物酶淬滅溶液（例如3％過氧化氫）中孵育細(xì)胞或組織樣品10分鐘來淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性。在室溫下用PBS沖洗兩次。
   

2. 可選：如果使用結(jié)合HRP的鏈霉親和素，建議通過shengwusu封閉緩沖液封閉內(nèi)源性shengwusu。
   

3. 在4°C下用shou選的封閉溶液（例如含1％BSA的PBS）封閉30分鐘。
   

4. 除去封閉溶液，并添加在推薦抗體稀釋液中稀釋的di一抗體，在室溫下放置60分鐘，或在4°C下放置過夜。
   

5. 用PBS洗滌3次，每次5分鐘。
   

6. 將100 µL二級(jí)抗體-HRP工作溶液應(yīng)用于每個(gè)樣品，并在室溫下孵育60分鐘。注意：孵育時(shí)間和濃度可以根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度而變化。
   

7. 用PBS洗滌3次，每次5分鐘。

酪酰胺標(biāo)記

1. 準(zhǔn)備并向每個(gè)樣品中加入100 µL的Tyramide工作溶液，并在室溫下孵育5-10分鐘。 注意：如果觀察到非特異性信號(hào)，則可以縮短與Tyramide的孵育時(shí)間。您應(yīng)該在不同的孵育時(shí)間點(diǎn)使用陽性和陰性對照樣品優(yōu)化孵育時(shí)間?；蛘吣梢栽诠ぷ魅芤褐惺褂幂^低濃度的乙酰胺。
   

2. 用PBS沖洗3次。

復(fù)染和熒光成像

1. 根據(jù)需要對細(xì)胞或組織樣本進(jìn)行復(fù)染。AAT提供了一系列核復(fù)染色試劑，如表1所示。請按照試劑隨附的說明進(jìn)行操作。
   

2. 使用具有防褪色特性的安裝介質(zhì)安裝蓋玻片。
   

3. 使用適當(dāng)?shù)倪^濾器設(shè)置以可視化來自Tyramide標(biāo)記的信號(hào)。

表1.建議用于核復(fù)染色的產(chǎn)品。

計(jì)算器

普通儲(chǔ)備溶液的制備

表1.將iFluor™488酪酰胺的特定質(zhì)量重構(gòu)至給定濃度所需的DMSO體積。請注意，該體積僅用于制備儲(chǔ)備溶液。有關(guān)適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)/生理緩沖液，請參閱樣本實(shí)驗(yàn)方案。

糖度計(jì)算器

輸入任何兩個(gè)值（質(zhì)量，體積，濃度）以計(jì)算第三個(gè)值。