與磷酸酯酶相互作用后，無色且無熒光的FDP水解為高度熒光的熒光素，該熒光素具有出色的光譜特性，可與大多數(shù)配備氬激光激發(fā)的熒光儀器的*檢測窗口相匹配?；蛘?，由于酶促產(chǎn)物（熒光素）顯示出大的消光系數(shù)（接近100,000 cm-1mol-1），因此FDP也可用于以發(fā)色模式檢測磷酸酶。在一些文獻(xiàn)中，F(xiàn)DP被認(rèn)為是zui敏感的熒光磷酸酶底物之一。FDP已廣泛用于各種ELISA分析中。另外，它還用于檢測laoansuan磷酸酶。FDP具有熱穩(wěn)定性，因此在存儲固體樣品和儲備溶液時需要特別注意。

1. 在Tris緩沖液（50 µL）中制備10-50 µM磷酸鹽

2. 添加磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品和/或測試樣品

3. 在室溫或37°C下孵育30至120分鐘

4. 在Ex / Em = 490/514 nm處監(jiān)控?zé)晒鈴?qiáng)度

重要說明
磷酸酶底物可以被未具體列出的磷酸酶檢測。以下是溶液中磷酸酶測定的推薦方案。該協(xié)議僅提供指南，應(yīng)根據(jù)具體需要進(jìn)行修改。

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1. FDP儲備溶液：
在ddH ₂ O中制備2至10 mM儲備溶液。注意：儲備溶液應(yīng)立即使用。

準(zhǔn)備工作溶液

FDP工作溶液（2X）：
在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將FDP溶解在ddH ₂ O中或在室溫下解凍等分的儲備溶液。在100 mM Tris緩沖液或您選擇的pH 8至9的緩沖液（不是磷酸鹽緩沖液）中，準(zhǔn)備2X的10至50 µM的工作溶液。

程序

1. 在磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個孔中加入50 µL 2X FDP工作溶液，使總磷酸酶測定體積為100 µL /孔。對于384孔板，在每個孔中加入25 µL樣品和25 µL 2X磷酸鹽工作溶液。
   

2. 在避光的條件下，將反應(yīng)在所需溫度下孵育30至120分鐘。
   

3. 使用熒光板讀數(shù)器在適當(dāng)?shù)臑V光片組上監(jiān)視熒光的增加。
   

4. 空白孔（僅使用測定緩沖液）中的熒光用作對照，并通過磷酸酶反應(yīng)從那些孔的值中減去。

計(jì)算器

普通儲備溶液的制備

表1.重構(gòu)特定質(zhì)量的FDP [熒光素二磷酸四銨鹽] * CAS 217305-49-2 *至給定濃度所需的水量。請注意，該體積僅用于制備儲備溶液。有關(guān)適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)/生理緩沖液，請參閱樣本實(shí)驗(yàn)方案。