ClearColi K12 電擊感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化，不能用于熱激轉(zhuǎn)化。ClearColi K12菌株來源于K12endA-recA-菌株。在K12 endA-recA-菌株中引入突變，導(dǎo)致ClearColi K12細(xì)胞壁外層的脂多糖(LPS)被修飾:LPS的低聚糖鏈被刪除，同時(shí)LPS的兩個(gè)?；溡脖粍h除，進(jìn)而破壞了ClearColi K12大腸桿菌的內(nèi)毒素信號(hào)通路，使得從該細(xì)胞中提取的蛋白或質(zhì)粒DNA中的內(nèi)毒素含量極低，提取的無內(nèi)毒素質(zhì)粒廣泛應(yīng)用于后續(xù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化。ClearColiK12同時(shí)缺失核酸內(nèi)切酶(endA)和重組酶(recA)，提高了質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。ClearColiK12電擊感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1X10cfu/μg DNA?；蛐蜑? FλΔendAΔ recAfrr181 msbA52Δ gutQΔ kdsDΔ lpxL Δ lpxMΔpagPlpxP A eptA

操作方法:1.0.1cm 電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5min,待其瀝干水分,正置5min,使乙醇充分揮發(fā),待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實(shí)冰面,電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5min充分降溫。2.取 -70℃保存的電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5min,待其融化,加入目的DNA(質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物)并用手boda離心管底輕輕混勻,避免產(chǎn)生氣泡,立即插入冰中。A.測(cè)定轉(zhuǎn)化效率使用1μl 0.1ng/μl 的對(duì)照質(zhì)粒pUC19;B.對(duì)于連接產(chǎn)物,請(qǐng)用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液(10mM Tris-HCl,pH7.5;1mM

EDTA)重懸,DNA濃度不超過100ng/μl,體積不超過5μl/50μl感受態(tài)。3.用 200μl 槍頭將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產(chǎn)生氣泡,蓋上杯蓋。4.啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25μF, PC=200Ω,V=1.8kV(BioRad電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù));或C=25μF,PC=200Ω.V=2.4kV(BTX ECM 630或Bio-Rad GenePulser電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù));也可按所用電轉(zhuǎn)儀推

薦的參數(shù)操作。將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中。5.2min后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入700μl不含抗生素的無菌S.O.C.培養(yǎng)基(室溫),用1ml

槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后,轉(zhuǎn)移到50ml離心管(BD Falcon50ml 錐形離心管等),向離心管中補(bǔ)加S.O.C.培養(yǎng)基至5ml。37C,225rpm復(fù)蘇60min。