高濃度金牌低生長因子基質(zhì)膠 是一種可溶性的基底膜基質(zhì)膠，這種基質(zhì)是通過基因編輯技術(shù)將多種表達膠原蛋白的基因序列插入到經(jīng)永生化處理的小鼠細胞體系中，并在實體中抽提出來的。它的主要成分是層粘連蛋白，接著是膠原蛋白IV、硫酸乙酰素蛋白多糖和巢蛋白。基底膜基質(zhì)也含有轉(zhuǎn)化生長因子β、表皮生長因子、類胰島素生長因子、成纖維細胞生長因子和在中自然出現(xiàn)的其他生長因子。

推薦應(yīng)用

     本系列分為標準高濃度和低因子高濃度，其濃度和粘度均高于普通濃度的基質(zhì)膠，更適用于體內(nèi)實驗(動物模型)，如PDX、CDX、體外血管生成實驗。

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品參數(shù)

來源：小鼠

外觀：①顏色：含酚紅基質(zhì)膠表現(xiàn)為黃色-粉紅色，無酚紅基質(zhì)膠表現(xiàn)為半透明淡黃色； ②形態(tài)：標準型基質(zhì)膠4℃溶解后，呈透明流動液態(tài)狀態(tài)；高濃度基質(zhì)膠0℃溶解后，呈透明流動液態(tài)狀態(tài)，4℃久置呈半凝膠狀。

濃度多樣性： 蛋白濃度范圍在8~26mg/mL之間

內(nèi)毒素： ≤ 4.5EU/ mL

凝膠時間：室溫條件下5-30min凝膠，溫度22°C至37°C時成膠速度加快

2D/3D應(yīng)用非常廣泛：干細胞研究(分化、維持）、研究（侵襲）、 3D細胞培養(yǎng)（類器官、3D細胞球）、體內(nèi)植入（皮下、血管生成、栓塞）

產(chǎn)品質(zhì)量控制規(guī)范

• 通過小鼠抗體產(chǎn)物（MAP）檢測進行常規(guī)小鼠菌落病原體篩選

• 提取自不含LDEV的小鼠細胞

• 對包括LDEV在內(nèi)的多種病原體進行廣泛的PCR檢測， 確保對生產(chǎn)過程中使用的原材料進行嚴格控制

• 對細菌、真菌和支原體進行檢測，確保陰性

• 使用BCA方法測定蛋白濃度

• 使用血清學(xué)方法檢測內(nèi)毒素水平

• 在37℃下進行14天的凝膠穩(wěn)定性測試

• 每批次產(chǎn)品進行生物學(xué)功能驗證（類器官培養(yǎng)與分化實驗；皮下成瘤實驗；干細胞培養(yǎng)；血管生成實驗等）

• 對包括LDEV在內(nèi)的多種病原體進行廣泛的PCR檢測， 確保對生產(chǎn)過程中使用的原材料進行嚴格控制

使用注意事項

實驗環(huán)境

 • 環(huán)境溫度：20–25℃ ；環(huán)境濕度：40–60%。

 • 請穿戴個人防護裝置，注意實驗室安全。

溫度控制  

• 基質(zhì)膠產(chǎn)品儲存在-20℃時是穩(wěn)定的。通過分裝并一次性使用分裝物來盡可能減少產(chǎn)品的凍融次數(shù)。在-20℃冰箱中儲存分裝物直到準備使用。請不要儲存在無霜冰箱中。請務(wù)必保持產(chǎn)品的凍存狀態(tài)。

• 因為?；?strong>高濃度金牌低生長因子基質(zhì)膠 在10℃以上會開始凝膠化。所以需謹記：?；?strong>高濃度金牌低生長因子基質(zhì)膠 和所有與?；?strong>高濃度金牌低生長因子基質(zhì)膠 接觸的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)基都應(yīng)該預(yù)冷。在實驗的全部過程中請務(wù)必保持?；?strong>高濃度金牌低生長因子基質(zhì)膠 處于冰上。

避免污染

• 實驗操作人員需嚴格區(qū)分實驗操作臺、清潔區(qū)和污染區(qū)，確保插取吸頭、加樣、丟棄吸頭的動作呈單向流動。

• 實驗后使用含 0.5% 次氯酸的消毒液對實驗操作區(qū)消毒。

其他

• 請將基質(zhì)膠產(chǎn)品小瓶淹沒在碎冰中，并放置在4℃冰箱里過夜解凍?；锘|(zhì)膠，蛋白濃度高時可能需要更多時間。請將?；?strong>高濃度金牌低生長因子基質(zhì)膠 全程保持在冰上。無論是開蓋取用產(chǎn)品或者對產(chǎn)品進行分裝，請保持無菌操作。

• 操作過程中，需使用預(yù)冷的移液管輕柔地吹打混勻?；?strong>高濃度金牌低生長因子基質(zhì)膠 以確保其均勻性。將模基生物高濃度金牌低生長因子基質(zhì)膠 分裝到離心管中，每當模基生物高濃度金牌低生長因子基質(zhì)膠 堵塞吸頭和/或移液管測量不精確時請更換吸頭。如果將產(chǎn)品放置在4℃的冰上 24-48個小時，凝膠化的?；?strong>高濃度金牌低生長因子基質(zhì)膠 可能會被重新水化。

操作說明

分裝操作說明

    基質(zhì)膠產(chǎn)品儲存在-20℃時是穩(wěn)定的。通過分裝并一次性使用分裝物來盡可能減少產(chǎn)品的凍融次數(shù)。以下為實驗操作者進行分裝操作說明。

1.將基質(zhì)膠置于預(yù)冷盒或碎冰中，放入 4℃冰箱，過夜解凍。

2.將無菌離心管、無菌槍頭等接觸基質(zhì)膠的耗材放預(yù)冷盒中或冰箱中預(yù)冷，分裝前將融化好的基質(zhì)膠表面清潔后放入預(yù)冷盒或碎冰上。

3.在潔凈工作臺中，用1mL移液槍吸取250µL基質(zhì)膠到離心管里(或根據(jù)每次用量多少進行分裝)，標注好信息，操作過程中盡量保持低溫，縮短操作時間。

4.分裝完成后放冰盒中，防止傾倒，并于冰箱保存。分裝后放置于-20℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。請不要儲存在自動除霜的冰箱中儲存。使用前將基質(zhì)膠插入預(yù)冷盒或碎冰中，并放置于4°C冰箱中，在冰上過夜解凍，使基底膜基質(zhì)膠在穩(wěn)定的低溫環(huán)境中緩慢充分融化。

使用方法說明

包被涂層方法   

    ?；?strong>高濃度金牌低生長因子基質(zhì)膠可以以幾種方式使用。薄層凝膠法適用于在凝膠頂部接種細胞，厚層凝膠法允許您在三維基質(zhì)內(nèi)培養(yǎng)細胞，薄層包被法(不凝膠化)給您提供了復(fù)雜的蛋白質(zhì)層，您可以在其上培養(yǎng)細胞。您的選擇基于您想要實現(xiàn)的最終結(jié)果，無論是細胞生長、附著還是分化。

一、薄層凝膠法

1.依照推薦的方法解凍?；锘啄せ|(zhì)。使用預(yù)冷的移液管，將模基生物 基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.將培養(yǎng)板放置在冰上，以 50 µl/cm2 向生長表面加入?；?基底膜基質(zhì)。

3.將培養(yǎng)板放置在 37 ℃，30 分鐘。

4.如果有必要的話，請在使用無血清培養(yǎng)基輕柔漂洗前吸出未結(jié)合的材料。請確保移液器的吸頭不要刮擦包被的表面。培養(yǎng)板現(xiàn)在可以使用了。

二、薄層包被法

1.依照推薦的方法解凍模基生物基底膜基質(zhì)。使用預(yù)冷的移液管，將?；?基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.使用無血清培養(yǎng)基將?；锘啄せ|(zhì)稀釋到需要的濃度。對于您的實驗應(yīng)用，您應(yīng)該完成以經(jīng)驗為主的研究來確定您的最適包被濃度。

3.向被包被的容器中加入稀釋的?；?基底膜基質(zhì)。加入的量應(yīng)該足以容易地覆蓋整個生長表面。在室溫下培養(yǎng) 1 個小時。

4.吸出未結(jié)合的材料并使用無血清培養(yǎng)基輕柔地漂洗。培養(yǎng)板現(xiàn)在可以使用了。

三、厚層凝膠法

1.依照推薦的方法解凍模基生物基底膜基質(zhì)。使用預(yù)冷的移液管，將?；?基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.將培養(yǎng)板放置在冰上。向?；锘啄せ|(zhì)中加入細胞并使用預(yù)冷的移液管懸浮。以150-200µl/cm2 向生長表面加入?；?基底膜基質(zhì)。

3.將培養(yǎng)板放置在37℃，30分鐘?，F(xiàn)在可以添加培養(yǎng)基了。細胞也可以培養(yǎng)在這一凝膠的頂部。

細胞復(fù)蘇：

   使用細胞復(fù)蘇溶液在冰上 7 小時內(nèi)解聚?；锘啄せ|(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)將生長在模基生物基底膜基質(zhì)上的細胞zuiyouxiao地復(fù)蘇，或者使用zhongxingdanbaimei，考慮到連續(xù)培養(yǎng)，zhongxingdanbaimei作為一種金屬酶可以分散細胞。

應(yīng)用操作說明

   以下以小鼠皮下成瘤實驗為例來進行?；?strong>高濃度金牌低生長因子基質(zhì)膠的應(yīng)用實驗操作說明。

一、實驗?zāi)康?/strong>

1、熟練掌握小鼠皮下成瘤技術(shù)

2、了解掌握多種細胞株皮下成瘤技術(shù)

3、觀察小鼠皮下接種細胞體內(nèi)成瘤形態(tài)的變化

二、實驗原理

    皮下成瘤實驗（包括了PDX，CDX和Syngeneic）是將細胞或組織通過原位或皮下移/植到小鼠體內(nèi)使其成瘤，在免疫學(xué)、藥品與生物制品的安全性評價及有效藥品的篩選等實驗方面，有著很高的研究價值。相對于單純的細胞種植，混合基質(zhì)膠后可顯著提高，縮短成瘤時間，其主要原因是基質(zhì)膠為細胞在接受宿主營養(yǎng)之前提供充足營養(yǎng)環(huán)境，起到橋梁的作用。實驗一般選擇4-8周齡的小鼠，雌雄均可，接種部位選擇皮下。一般一只小鼠接種細胞數(shù)量為1~5×106個細胞，倫理學(xué)要求不能超過1×107細胞/只，接種后2-3周出現(xiàn)肉眼較明顯的瘤塊（具體根據(jù)細胞、增殖速度、細胞接種量、小鼠品系等因素有所不同）。

三、實驗儀器、材料

1、儀器：生物安全柜、細胞培養(yǎng)箱、低溫水平式離心機、倒置顯微鏡

2、材料：無菌槍頭；10 cm細胞培養(yǎng)皿；無菌EP管；一次性注射器等耗材，可根據(jù)實驗設(shè)計自行調(diào)整

3、試劑：基質(zhì)膠、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、含10%胎牛血清培養(yǎng)基、1×PBS、yimei細胞消化液

四、實驗內(nèi)容與方法

4.1實驗準備：

將基質(zhì)膠置于特制的冰盒內(nèi)，于4℃冰箱中過夜緩慢融化；

4.2 細胞準備：

4.2.1選取狀態(tài)良好的、對數(shù)生長的細胞，棄上清，加入2 mL 1×PBS溶液輕輕晃動清洗，棄掉液體。

4.2.2加入1 mL 0.25%yimei細胞消化液到培養(yǎng)皿中，靜置10秒后，棄掉yimei，用殘留的yimei繼續(xù)室溫消化1~3分鐘。

4.2.3待細胞變圓時（切記不可消化到細胞邊緣透亮），加入1 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。小心將細胞吹散，制成細胞懸液收集至15 mL塑料離心管中。

4.2.4 1000 rpm離心3分鐘，棄上清。PBS清洗細胞1次后，加入無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細胞，取10 μL細胞懸液進行細胞計數(shù)。

4.2.5

? HepG2細胞：每只小鼠接種500萬個細胞。根據(jù)細胞密度取所需細胞懸液至無菌1.5 mL塑料離心管中，1000 rpm離心3分鐘，棄上清，補充無血清培養(yǎng)基或PBS至總體積為300 μL。對于空白對照組，因不需要與基質(zhì)膠混合，只需終濃度制備成5×107 個細胞/mL即可，取600μL備用。

? HCT-116細胞：每只小鼠接種100萬個細胞。根據(jù)細胞密度取所需細胞懸液至無菌1.5 mL塑料離心管中，1000 rpm離心3分鐘，棄上清，補充無血清培養(yǎng)基或PBS至總體積為300 μL。對于空白對照組，因不需要與基質(zhì)膠混合，只需終濃度制備成1×107 個細胞/mL即可，取600μL備用。

? MIA-PaC-2細胞：每只小鼠接種1000萬個細胞。根據(jù)細胞密度取所需細胞懸液至無菌1.5 mL塑料離心管中，1000 rpm離心3分鐘，棄上清，補充無血清培養(yǎng)基或PBS至總體積為500μL。對于空白對照組，因不需要與基質(zhì)膠混合，只需終濃度制備成5×107 個細胞/mL即可，取1000μL備用。

2.4 基質(zhì)膠混合：將細胞懸液和基質(zhì)膠在4℃環(huán)境下按1:1比例混勻。空白對照組可直接進行皮下/注射。

2.5皮下/注射：左手抓取固定裸鼠，于裸鼠右側(cè)背部皮下/注射，接種時，針頭在皮下進針深一點，約1 cm深，以減少注射后細胞懸液從針眼溢出，接種體積為100 μL。MIA-PaC-2細胞需注射200 μL/只。

2.6記錄數(shù)據(jù)：將裸鼠放回籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)，根據(jù)實驗需要定期測量瘤體體積，記錄數(shù)據(jù)做出曲線，并在體積不超過2000 mm3前對裸鼠進行Euthanasia，取出，拍照。