分析方案

概述

準(zhǔn)備細(xì)胞

添加染料工作溶液

在37°C孵育30分鐘至2小時(shí)

在熒光顯微鏡下Ex / Em = 630 / 650nm（Cy5濾光片組）處進(jìn)行分析

操作方法

1.準(zhǔn)備溶酶體染色溶液：

1.1解凍LysoBrite NIR（組分A）至室溫。

1.2通過將20μLLysoBrite NIR（組分A）稀釋到10mL活細(xì)胞染色緩沖液（組分B）中制備染料工作溶液。

注1：對(duì)于一個(gè)96孔板，20μLLysoBrite NIR（組分A）就足夠了。 將未使用的LysoBrite NIR（組分A）等分并儲(chǔ)存在<-20℃。 避光，避免反復(fù)凍融循環(huán)。

注2：熒光溶酶體指示劑的濃度根據(jù)具體應(yīng)用而變化。 可以根據(jù)特定細(xì)胞類型和細(xì)胞或組織對(duì)探針的滲透性來修改染色條件。

2.準(zhǔn)備和染色細(xì)胞：

2.1對(duì)于粘附細(xì)胞：在96孔黑色壁/透明底板（100μL/孔/ 96孔板）中或在裝有適當(dāng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需的匯合時(shí)，加入等體積（如100μL/孔/ 96孔板）的染料加工溶液（來自步驟1.2）。將細(xì)胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育30分鐘至2小時(shí)。使用配有Cy5濾光片的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

注意：如果細(xì)胞看起來沒有充分染色，建議增加標(biāo)記濃度或孵育時(shí)間以使染料積累。

2.2對(duì)于懸浮細(xì)胞：以1,000rpm離心細(xì)胞5分鐘以獲得細(xì)胞沉淀并吸出上清液。在預(yù)熱的生長培養(yǎng)基中輕輕重懸細(xì)胞沉淀，然后加入等體積的染料加工溶液（來自步驟1.2）。將細(xì)胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育30分鐘至2小時(shí)。使用配有Cy5濾光器的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

注1：如果細(xì)胞看起來沒有充分染色，建議增加標(biāo)記濃度或培養(yǎng)時(shí)間以使染料積累。

注2：懸浮細(xì)胞可以附著在用BD Cell-Tak®（BD Biosciences）處理過的蓋玻片上，并作為貼壁細(xì)胞染色（見步驟2.1）。

圖1.使用具有Cy5過濾器組的Olympus熒光顯微鏡在Costar黑色96孔板中用Cell Navigator TM溶酶體染色試劑盒染色的Hela細(xì)胞的圖像。