試驗(yàn)方案

1. 準(zhǔn)備細(xì)胞

2. 添加染料工作溶液

3. 在37°C孵育30分鐘至2小時

4. 在熒光顯微鏡下Ex / Em = 575 / 597nm處進(jìn)行分析

注意：1）實(shí)驗(yàn)前，取出轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行室溫凍結(jié)。

樣品示例及使用方法

1.準(zhǔn)備溶酶體染色溶液：

1.1  取出試劑盒中A、B組分，室溫避光靜置5-10min。

1.2  移取20μLLysoBrite Red（組分A），用10mL活細(xì)胞染色緩沖液（組分B）進(jìn)行稀釋，制備染料工作液。

注意：1) 20μL的500XLysoBrite Red （組分A）足夠完成一個96孔板，根據(jù)要求分裝并儲存未使用的500XLysoBrite Red（組分A）,避免反復(fù)凍融。

       2)熒光溶酶體指示劑的濃度根據(jù)實(shí)際應(yīng)用而改變，可以根據(jù)探針的滲透性對細(xì)胞類型、細(xì)胞或組織的染色條件進(jìn)行調(diào)整。

2.細(xì)胞染色：

2.1對于貼壁細(xì)胞：

在96黑色/透明微孔板（100μL/孔/ 96孔板）或裝有適當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)的培養(yǎng)皿的蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需的匯合時，在96孔板或培養(yǎng)皿內(nèi)加入等量的LysoBrite Red工作液，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，用預(yù)溫(37°C) Hanks和20 mM Hepes緩沖液(HBSS)或自配的緩沖液清洗細(xì)胞兩次，用HBSS或生長培養(yǎng)基填充細(xì)胞孔，再使用配有TRITC過濾器組的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，使之帶紅色熒光(Ex/Em = 575/600 nm)。

注意：1）如果細(xì)胞看起來沒有充分染色，建議適當(dāng)增加染料濃度或孵育時間。

2.2對于懸浮細(xì)胞：

向細(xì)胞中加入等量的LysoBrite Red工作液。在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，用預(yù)溫(37°C) Hanks和20 mM Hepes緩沖液(HBSS)或自配的緩沖液清洗細(xì)胞兩次，用HBSS或生長培養(yǎng)基填充細(xì)胞孔，再使用配有TRITC過濾器組的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，使之帶紅色熒光(Ex/Em = 575/600 nm)。

注意:  1）如果細(xì)胞看起來沒有充分染色，建議適當(dāng)增加染料濃度或孵育時間。

        2）懸浮細(xì)胞可以附著在用BD Cell-Tak®（BD Biosciences）處理過的蓋玻片上，并作為貼壁細(xì)胞染色。

示例數(shù)據(jù)分析及圖示

圖一：在Costar黑色透明底96孔板中用Cell Navigator 溶酶體染色試劑盒染色Hela細(xì)胞的熒光成像結(jié)果。

圖二：HeLa細(xì)胞分別用A和B，置于Costar黑壁/透明底96孔板中染色后的熒光成像結(jié)果，在0秒和120秒的曝光時間下，使用Olympus熒光顯微鏡對信號進(jìn)行比較。A: Cell Navigator溶酶體染色試