Bucculite FdU 細(xì)胞增殖熒光成像試劑盒是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測(cè)細(xì)胞活力的試劑盒，監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖是評(píng)估細(xì)胞活力，細(xì)胞周期和遺傳毒性的可靠方法之一。檢測(cè)細(xì)胞增殖的一種基本方法是在細(xì)胞生長(zhǎng)的S期過(guò)程中，在存在胸腺嘧啶核苷的情況下測(cè)量DNA合成。該細(xì)胞增殖熒光成像試劑盒使用FOL-FdU（胸苷的類似物）。FOL-FdU在DNA合成過(guò)程中被摻入細(xì)胞DNA中。固定細(xì)胞后，通過(guò)我們的Bucculite 標(biāo)記技術(shù)用MTA-iFluor 555標(biāo)記摻入的FOL-FdU。在FITC通道中可視化細(xì)胞中形成的iFluor 555標(biāo)記的DNA。該 細(xì)胞增殖熒光成像試劑盒提供了基于抗BrdU抗體的檢測(cè)和EdU點(diǎn)擊化學(xué)檢測(cè)的替代方法。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Bucculite FdU 細(xì)胞增殖熒光成像試劑盒。

樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡(jiǎn)要概述

1.準(zhǔn)備細(xì)胞（對(duì)于96孔板為100 µL /孔，對(duì)于384孔板為25 µL /孔）

2.對(duì)于96孔板，以100 µL /孔添加2X FOL-FdU工作溶液

3.在37oC下孵育3小時(shí)

4.取出培養(yǎng)基，并在室溫下用100µL冰冷的90％甲醇的PBS溶液固定細(xì)胞15分鐘

5.除去固定液并用PBS洗滌3次

6.加入1X iFluor 555-MTA工作溶液（100 µL /孔）并在室溫下染色30分鐘。

7.除去每個(gè)孔中的工作溶液，并用1X洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞3次。

8.加入100µL 1X洗滌緩沖液/孔，并用FITC濾光片組觀察紫外熒光顯微鏡。

溶液配制

1.儲(chǔ)備溶液配制

所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1.1 FOL-FdU儲(chǔ)備溶液（1000X）：
將500 µL DMSO（組分E）添加到FOL-FdU（組分A）中，制成1000X儲(chǔ)備溶液。注意：此1000X濃度是使用具有佳FOL-FdU濃度的HeLa細(xì)胞開發(fā)的。生長(zhǎng)培養(yǎng)基，細(xì)胞密度，細(xì)胞類型變化和其他因素可能會(huì)影響標(biāo)記。我們建議測(cè)試一系列FOL-FdU濃度，以確定適合您的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)條件的佳濃度。

1.2 iFluor 488-MTA儲(chǔ)備溶液（400X）：
將50 µL DMSO（組分E）添加到iFluor 555-MTA（組分B）中，制成400 X iFluor 555-MTA儲(chǔ)備溶液。

2.工作溶液

2.1 2X FOL-FdU工作溶液

在培養(yǎng)基中將1000X FOL-FdU儲(chǔ)備溶液稀釋500倍，以制備2X FOL-FdU工作溶液。

2.2 1X iFluor 555-MTA工作溶液

將2.5 µL 400X iFluor 555-MTA儲(chǔ)備溶液添加到1mL染色緩沖液（組分C）中，以制備1X iFluor 555-MTA工作溶液。

2.3 X洗滌緩沖液

向9mL PBS中加入1mL 10X洗滌緩沖液（組分D），制成1X 洗滌緩沖液。

操作步驟

1.準(zhǔn)備細(xì)胞

1.1對(duì)于貼壁細(xì)胞：將細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以10,000至40,000個(gè)細(xì)胞/孔/ 100 µL（對(duì)于96孔板）過(guò)夜培養(yǎng)，以2,500至10,000個(gè)細(xì)胞/孔/ 20 µL（對(duì)于384孔板）過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2對(duì)于非貼壁細(xì)胞：離心培養(yǎng)液中的細(xì)胞，并將細(xì)胞沉淀以1-2 X 106細(xì)胞/ ml（對(duì)于10個(gè)96孔板為10 mL）懸浮在培養(yǎng)液中。注意：應(yīng)單獨(dú)評(píng)估每個(gè)細(xì)胞系，以確定佳細(xì)胞密度。

2.用FOL-FdU標(biāo)記細(xì)胞

2.1將等體積的2X FOL-FdU工作溶液添加到含有要處理的細(xì)胞的培養(yǎng)基中，以在每個(gè)孔中獲得1X FOL-FdU溶液。我們不建議更換所有培養(yǎng)基，因?yàn)檫@可能會(huì)影響細(xì)胞增殖速率。

2.2在適合細(xì)胞類型的條件下孵育細(xì)胞3小時(shí)。FOL-FdU暴露于細(xì)胞的時(shí)間可以直接測(cè)量合成DNA的細(xì)胞。孵育時(shí)間取決于細(xì)胞生長(zhǎng)速率。

3.細(xì)胞固定

3.1孵育后，移出培養(yǎng)基，并向每個(gè)孔中加入100µL冰冷的PBS中的90％甲醇（未提供，甲醇/ PBS，v / v為90/10），并在室溫下孵育15分鐘。

3.2除去固定緩沖液，并用PBS清洗每個(gè)孔中的細(xì)胞兩次。

4.染色細(xì)胞

4.1在細(xì)胞板中加入100 µL /孔（96孔板）或50 µL /孔（384孔板）的1X iFluor 488-MTA工作溶液。在避光的條件下，將細(xì)胞與工作溶液在室溫下孵育30分鐘。

4.2除去每個(gè)孔中的工作溶液。

4.3用1X洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞3次，洗滌后每孔加入100µL洗滌緩沖液。注意：如果需要Hoechst 33342染色劑，請(qǐng)?jiān)?X洗滌緩沖液中制成5-10 µg / ml Hoechst 33342溶液并染色30分鐘。

4.4使用帶有FITC濾光片組的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中的熒光信號(hào)。