一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品 (以 10E1- 10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)  。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高 ,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行 ,千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分)  。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原 , 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1. 標(biāo)記 6 個離心管 ,分別為 6 ,5 ,4 ,3 ,2 ,  1。

2.    用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液 , 用帶芯槍頭, 下同)  。

3.   在 6 號管中加入 5 μL 1 × 10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震 蕩 1 分鐘 ,得 1 × 10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品 。放冰上待用。

4.   換槍頭 ,在 5 號管中加入 5 μL 1 × 10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),充分震蕩 1 分鐘,得 1 × 10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.   換槍頭 ,在 4 號管中加入 5 μL 1 × 10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),充分震蕩 1 分鐘,得 1 × 10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品 。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個樣品, 設(shè)置 N+2 個提取,多出的一個是 PC (樣品制備陽性 對照)  ,一個是 NC (樣品制備陰性對照)  ?？梢杂?10μL 上步所得 4 號稀

釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積 一樣 , 以此作為 PC 。另外用水作為 NC。

8.    用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)樣品 DNA 提取試劑

盒兼容 。也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。

三、Probe qPCR 反應(yīng) ( 20μL 體系 ,在樣品制備室進(jìn)行)

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù) ,則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管 ,其中 N+2 個 用于上步得到的 N+2 個樣品 ,   1 個用于 PCR 陰性對照 (用水做模板)  ,6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線 。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù) ,則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品 ,1 個用于 PCR 陰性對照 (用 水做模板)  ,  1 個用于 PCR 陽性對照 (直接用第 6 步第 4 號管的陽性對照 稀釋液做模板)  。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分 (本表只列出一次重復(fù) 。樣品管和陰性對照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好 后 加)  :