由于ELISA法一方面是建立在抗原與抗體免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，因而，具有特異性。而另一方面又由于酶標(biāo)記抗原或抗體是酶分子與抗原或抗體分子的結(jié)合物，它可以催化底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生放大作用，正因為此種放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此，ELISA法是一種既敏感又特異的方法。, U8 [  y$ z8 g# K（ `4 U2 Y
ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：6 U/ R（ B8 w. _3 D） s" {. X
（1）固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；
（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；; G# N. `（ I H5 L* L$ a
（3）酶反應(yīng)的底物。$ j8 ^3 @. X. p6 Y8 n1 m
根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：& T6 ?- D6 i; Q0 r" W
雙抗體夾心法測抗原
雙抗體夾心法，屬于非競爭結(jié)合測定。它是檢測抗原zui常用的ELISA，適用于檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測。" K! q% {/ _6 W; M$ P6 y, ~
其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗體和酶標(biāo)抗體的量相對于待測抗原是過量的,因此復(fù)合物的形成量與待測抗原的含量成正比（在方法可檢測范圍內(nèi)）。測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量（OD值），即可確定待測抗原含量。 
 若固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個不同的抗原決定簇結(jié)合，則屬于雙位點夾心法。
 若采用固相載體上的抗原和酶標(biāo)抗原分別與樣品中被檢測抗體分子結(jié)合，則是雙抗原夾心法。, _* A3 l, {$ l* x" j4 p
操作步驟：
 （1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
 （2）加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
 （3）加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。
 （4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測知標(biāo)本中抗原的量。（ R8 ~# I） M  S" E
 在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標(biāo)用的抗體分別取自不同種屬的動物。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng)，作一步檢測。
 現(xiàn)多采用針對單一抗原決定簇特異性的單克隆抗體做固相化和酶標(biāo)抗體，則受檢樣品和酶標(biāo)抗體可一次性加入，簡化流程，縮短反應(yīng)時間。若標(biāo)本中待測抗原濃度過高，抗原可分別與酶標(biāo)抗體和固相抗體結(jié)合而不形成上述夾心復(fù)合物（類似于免疫沉淀反應(yīng)中抗原過剩時的后帶現(xiàn)象），使zui終結(jié)果低于實際含量（鉤狀效應(yīng)），甚至出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。因此對此類標(biāo)本應(yīng)適當(dāng)稀釋后再測定。另外，當(dāng)血清中存在類風(fēng)濕因子（RF）時，類風(fēng)濕因子（RF）可充當(dāng)抗原，而形成固相抗體-類風(fēng)濕因子-酶標(biāo)抗體夾心復(fù)合物，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
  在一步法測定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成"夾心復(fù)合物"。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象，此時反應(yīng)后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結(jié)果將低于實際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)（hook effect），因為標(biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應(yīng)注意可測范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。
　　假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。但在HBsAg的檢測中應(yīng)注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問題。
　　雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標(biāo)本中如含有RF，它可充當(dāng)抗原成份，同時與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽性反應(yīng)。采用F（ab）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標(biāo)。$ ]2 I0 W5 J! W7 B
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　　雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
`　　雙抗原夾心法用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物，此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測常采用雙抗原夾心法。雙抗原夾心法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。* E） @）