C。Immunoblotting

用Blotto（BlottoA或B；用抗牛第二抗體時(shí)建議使用BSA）封閉膜上的非特異位點(diǎn)，室溫孵育30-60min。也可選擇用不含Tween-20的Blotto，在封閉容器內(nèi)4℃過(guò)夜孵育。

如果使用的是磷酸化特異抗體，建議向封閉液和抗體稀釋液中加入50 mM NaF（NaF：sc-24988）抑制磷酸化酶。

封閉好的膜與*抗體（Blotto稀釋）稀釋液室溫孵育1小時(shí)。（如果是磷酸化特異抗體，要用加了50 mM NaF的Blotto稀釋液。）抗體*濃度根據(jù)滴度決定。建議起始稀釋度為0.5-2.0μg/ml。用TBST洗膜3次，5min/次。

將膜與HRP或AP標(biāo)記的第二抗體稀釋液（Blotto稀釋）室溫孵育45min，稀釋度1:500-1:2000。如果背景過(guò)高，第二抗體需進(jìn)一步稀釋（可達(dá)1:20000）。作ECL時(shí)，如果使用Cruz Marker^TM分子量標(biāo)準(zhǔn)（sc-2035），必須使用Cruz Marker^TM compatible secondary antibody作為可視化標(biāo)準(zhǔn)。

TBST洗膜3次，5min/次，然后TBS洗膜一次，5min。

將膜與化學(xué)發(fā)光試劑（sc-2408）孵育。如果發(fā)光化合物用于可見(jiàn)光檢測(cè)，必須用HRP標(biāo)記的第二抗體。

2．IP甲酸基肽受體1抗體說(shuō)明書(shū)，Anti-FPR1價(jià)格

注意：本操作步驟可用于放射性或正磷酸鹽標(biāo)記的細(xì)胞。（放射性物質(zhì)的使用及處理應(yīng)遵循適當(dāng)?shù)臈l例如OSHA和NRC指導(dǎo)手冊(cè)。）細(xì)胞標(biāo)記必須在無(wú)待標(biāo)記氨基酸殘基或無(wú)磷酸鹽的培養(yǎng)基中進(jìn)行。建議標(biāo)記前使細(xì)胞處于適當(dāng)?shù)酿囸I狀態(tài)。孵育培養(yǎng)細(xì)胞（100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上約80-90%

單層細(xì)胞匯合或培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)含約2-5×10⁷個(gè)懸浮細(xì)胞）。通常，用傳代貼壁細(xì)胞或2-5×10⁷個(gè)懸浮細(xì)胞可得到*標(biāo)記。

用21號(hào)注射器針頭或超聲波反復(fù)裂解細(xì)胞。轉(zhuǎn)移裂解物至微量離心管中。

可選擇：用1.0ml冰預(yù)冷的RIPA沖洗細(xì)胞培養(yǎng)皿，與之前的合并處理。

4℃，10000×g離心10min。冰上轉(zhuǎn)移上清（細(xì)胞溶解液）至新的微量離心管。

預(yù)處理細(xì)胞溶解液，加入1.0μg的control IgG（與*抗體的種屬來(lái)源一致）和20μl懸浮的（25%v/v）瓊脂糖偶聯(lián)物（A蛋白-瓊脂糖，G蛋白-瓊脂糖，A/G蛋白-瓊脂糖，或L蛋白-瓊脂糖）。4℃孵育30min。

2500rpm（約1000×g），4℃離心30s。

轉(zhuǎn)移上清或約100-1000μg總細(xì)胞蛋白至微量離心管中。加入1-10μl（如0.2-2μg）*抗體（抗體濃度應(yīng)滴定測(cè)定），4℃孵育1-2hrs。或者，可加入20μl*抗體瓊脂糖偶聯(lián)物，混勻，4℃孵育1hr-過(guò)夜；跳過(guò)下一步驟。

加入20μl適當(dāng)?shù)沫傊桥悸?lián)物懸浮液（A蛋白-瓊脂糖，G蛋白-瓊脂糖，A/G蛋白-瓊脂糖，或L蛋白-瓊脂糖）。蓋好管子，4℃振搖孵育1hr-過(guò)夜。

2500rpm（約1000×g），4℃離心30s，收集免疫沉淀物，小心吸棄上清。

用1.0ml RIPA裂解緩沖液或PBS輕輕洗滌沉淀2-4次，每次重復(fù)以上離心步驟。

zui后一次洗滌后，小心吸棄上清，用40μl 2×電泳上樣緩沖液（sc-24945）重懸沉淀。

樣品煮沸2-3min，上樣電泳分離免疫復(fù)合物，通過(guò)放射自顯影觀察結(jié)果。未用完的樣品可保存在-20℃。

可選擇：煮沸后，樣品可經(jīng)離心沉淀瓊脂糖顆粒，然后SDS-PAGE分析上清。