2500rpm（約1000×g），4℃離心30s。轉(zhuǎn)移上清（細(xì)胞溶解物）至干凈的微量離心管。

1ml細(xì)胞溶解物或約100-1000μg總細(xì)胞蛋白，加入10μl*抗體瓊脂糖偶聯(lián)物，混勻，4℃孵育1hr-過夜。

可選擇：如無*抗體瓊脂糖偶聯(lián)物，1ml細(xì)胞溶解物加入1-10μl（如0.2-2μg）*抗體（抗體濃度應(yīng)滴定測定），4℃孵育1-2hrs。加入20μl適當(dāng)?shù)沫傊桥悸?lián)物懸浮液（A蛋白-瓊脂糖，G蛋白-瓊脂糖，A/G蛋白-瓊脂糖，或L蛋白-瓊脂糖）。蓋好管子，4℃振搖孵育1hr-過夜。

2500rpm（約1000×g），4℃離心30s，收集免疫沉淀物，小心吸棄上清。

用1.0ml RIPA裂解緩沖液或PBS輕輕洗滌沉淀2-4次，每次重復(fù)以上離心步驟。

zui后一次洗滌后，小心吸棄上清，用40μl 2×電泳上樣緩沖液（sc-24945）重懸沉淀。

樣品煮沸2-3min。0.75mm×1.0mm的上樣孔上樣5-10μl。

電泳并按WB程序作免疫雜交。

從100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（單層細(xì)胞80-90%匯合）移除培養(yǎng)基，PBS洗一次。

加入1-3ml冰預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液（sc-24948），4℃孵育10min。（注意：RIPA裂解緩沖液對某些激酶效果不好。需要優(yōu)化裂解液成分來保持激酶活性。）

用21號注射器針頭反復(fù)抽吸使細(xì)胞破碎充分，轉(zhuǎn)移至15ml離心管中。

用1ml冰預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液，0.5%Triton X-100（sc-29112）沖洗培養(yǎng)皿，與原裂解液合并。

10000×g，4℃離心10min。4℃轉(zhuǎn)移上清至新的離心管內(nèi)。

轉(zhuǎn)移1.0ml細(xì)胞提取物（上清）至1.5ml離心管中。加入1-10μl（0.2-2μg）*抗體（抗體*濃度經(jīng)滴定測定），4℃孵育1hr。

加入20μl適當(dāng)?shù)沫傊桥悸?lián)物懸浮液（（A蛋白-瓊脂糖，G蛋白-瓊脂糖，A/G蛋白-瓊脂糖，或L蛋白-瓊脂糖）。蓋好蓋子，4℃振搖孵育1hr-過夜。

2500rpm（約1000×g），4℃離心5min，收集免疫沉淀復(fù)合物。小心吸棄上清。

1.0ml /次RIPA或PBS洗沉淀4次，每次重復(fù)上述離心步驟。

20μl適當(dāng)?shù)牡鞍准っ妇彌_液重懸沉淀（如50mM HEPES（sc-29097），0.1mM EDTA（sc-29092），0.01%BRIJ 35（sc-29087）），0.1mg/ml BSA，0.1% β-巰基乙醇（sc-29086），0.15M NaCl（sc-29108）。緩沖液成分根據(jù)所研究的激酶調(diào)整。

加入10-1000ng多肽底物。該底物/酶/細(xì)胞系的多肽底物濃度應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗決定。

準(zhǔn)備1ml ATP混合物：930μl適當(dāng)?shù)牡鞍准っ妇彌_液，6μl 50mM ATP，pH7.0，20μl 2.0 M MgCl₂和44μl [γ³²P]-ATP[10mCi/ml]。每個樣品加入10μl ATP混合物，30℃孵育30min。冰上放置。

加入等體積2×電泳上樣緩沖液（sc-24945）終止反應(yīng)，樣品煮沸2-3min。樣品可離心沉淀瓊脂糖微珠（可選擇）；分析上清。跑SDS-PAGE，通過放射自顯影觀察結(jié)果。未用完的樣品保存在-20℃。檢測中如用小肽底物，樣品必須通過閃爍計數(shù)或其他標(biāo)準(zhǔn)方法而不是SDS-PAGE來分析。