多巴胺β羥化酶抗體說明書，Anti-DBH

TRANSCRUZ^TM 超凝膠遷移檢測

用多聚核苷酸激酶將[γ³²p]-ATP 標(biāo)記到寡核苷酸上，達(dá)到50,000cpm/ng

準(zhǔn)備膠遷移緩沖液：10mMTris,Ph7.5, 50mMNaCL,1mMDTT,1mM EDTA,5%甘油

準(zhǔn)備20ul的反應(yīng)混合物，將3-10ug核抽提物，和1ug多聚dIdC溶解在20ul膠轉(zhuǎn)移緩沖液中。加0.5ng標(biāo)記的寡核苷酸探針，室溫孵育20分鐘。這組成了檢測DNA-蛋白復(fù)合物的對(duì)照樣品

為了檢測抗體遷移或封閉DNA-蛋白復(fù)合物，按步驟3準(zhǔn)備反應(yīng)混合物，每20ul反應(yīng)體積加1-2ul TransCruz^TM 超凝膠遷移抗體。一般是在加了探針之后，才加抗體，但在加探針前加入抗體，可使結(jié)果加強(qiáng)

通過4% 聚丙烯酰胺凝膠電泳（25-30ma）,分開DNA和蛋白復(fù)合物。凝膠中含50mMTris,Ph7.5, 2mM EDTA,0.38M甘油.待膠干后，自動(dòng)放射顯影查看結(jié)果

肽的中和

對(duì)所有的santa cruz的親和純化的兔或山羊的多抗和單抗，都有相應(yīng)的封閉肽做對(duì)照。通過將抗體和封閉肽的預(yù)先孵育，抗體對(duì)抗原的結(jié)合可以被阻止。

決定zui高的抗體稀釋度，在這個(gè)稀釋度下，可以一直獲得理想的陽性結(jié)果。例如，H-Ras在免疫沉淀時(shí)，推薦的濃度是1ug/ml,但陽性結(jié)果是在50ng/ml。

封閉/競爭時(shí)，將抗體（抗體濃度按照以前提到的方法確定）和5倍重量的封閉肽混合在500ul的PBS中，室溫孵育2小時(shí)，或4度過夜。

封閉/競爭后，用封閉緩沖液稀釋抗體/封閉肽混合物，然后，按照所期望的實(shí)驗(yàn)的操作進(jìn)行。

染色質(zhì)免疫沉淀

注意：CHIP的實(shí)驗(yàn)步驟可以有很多不同版本，下面介紹的步驟適合大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)

常溫下，用PBS洗細(xì)胞，重懸細(xì)胞，使細(xì)胞數(shù)大約5*10⁵個(gè)/ml（總細(xì)胞數(shù)2*10⁷）。,

加甲醛，使終濃度為1%，室溫孵育10分鐘。

加*至終濃度0.125M，終止交聯(lián)反應(yīng)

2000rpm,5分鐘，離心細(xì)胞。用冷的PBS洗細(xì)胞一次

用6ml的裂解緩沖液重懸細(xì)胞，輕柔混合，2000rpm離心5分鐘，收集粗提的核提取物。

再用PBS洗沉淀，沉淀可以凍存，或繼續(xù)以下步驟。

用1.9ml的高鹽裂解緩沖液重懸沉淀，轉(zhuǎn)移到2ml的離心管中準(zhǔn)備超聲

超聲條件需要優(yōu)化，下面介紹的條件是在使用Sonics VC130和3mm的探頭的基礎(chǔ)上建立起來的：多巴胺β羥化酶抗體說明書，Anti-DBH

在冰上操作，輸出功率設(shè)置5（R）6,每隔30秒超聲一次，共4次。

4°C，10，000rpm 離心15分鐘，保存上清，確定上清中蛋白的濃度。

如果免疫沉淀，我們推薦100—500ug蛋白和0.1—1ul的TransCruz試劑（0.2—2ug）

注意：研究者可能希望使用連接有葡聚糖或磁珠的一抗，以便于選擇后續(xù)免疫沉淀的試劑。有些情況下，將針對(duì)同一種蛋白不同表位的抗體聯(lián)合使用會(huì)更好。

向染色質(zhì)溶液加50ul Protein A/G-瓊脂糖，4度，孵育30分鐘，使其澄清，zui大速度，4度離心5分鐘。

向上清中加一抗，4度孵育過夜。

加50ul Protein A/G –瓊脂糖，4度孵育2小時(shí)。

12，000rpm離心20秒收獲磁珠，并將管放在冰上

用1ml裂解緩沖液洗磁珠2次

用沖洗緩沖液洗磁珠四次

重懸磁珠在400ul洗脫緩沖液中

通過在67度水浴中孵育管子2小時(shí)以上，使反向交叉連接

離心去除磁珠，繼續(xù)在67度水浴孵育上清過夜 Remove

10,000rpm離心3分鐘去除殘留的珠子，保留上清

分離DNA,用500ul 酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）抽提上清,劇烈振蕩，14,000rpm離心3分鐘分離兩相。

保留水相，用100ul10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.1 （TE）  反向抽提有機(jī)相一次，在匯集水相

用600ul 氯仿/異戊醇抽提匯集的水相

DNA可以用商業(yè)化的試劑盒濃縮。