富半*肝素結(jié)合蛋白61抗體說明書

siRNA小干擾RNA

l  *天：準備細胞

健康的細胞是成功轉(zhuǎn)染的要求，在轉(zhuǎn)染前明確細胞的生存狀態(tài)

對于貼壁細胞：

1，吸棄培養(yǎng)基，用*、EDTA、或其他合適的方法分散細胞，在*化前，用無菌的1X PBS漂洗細胞2次。

2，一旦細胞分散，用4倍體積的含10% 胎牛血清不含抗生素的生長培養(yǎng)基（如DEME,RMPI1640）稀釋懸浮液 。

（注意：這個階段使用不含抗生素的培養(yǎng)基是轉(zhuǎn)染成功的關(guān)鍵）

3，1,000 rpm離心5分鐘，去除培養(yǎng)基，用不含抗生素的培養(yǎng)基重懸沉淀

4，轉(zhuǎn)移細胞到12孔的細胞培養(yǎng)板 以便細胞過夜培養(yǎng)后，細胞覆蓋率達60-80%

（注意：細胞覆蓋率也是成功轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵）

對于懸浮細胞：

1，1,000 rpm離心5分鐘

2，去除培養(yǎng)基，用不含抗生素的含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基重懸沉淀

3，轉(zhuǎn)移細胞到12孔的細胞培養(yǎng)板或轉(zhuǎn)到多聚賴氨酸包被的8孔板中，以便細胞過夜培養(yǎng)后，細胞覆蓋率達60-80%

（注意：多聚賴氨酸包被是使懸浮細胞黏附到板底必須的）

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l  第二天

 準備轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染

 注意：對于不同的實驗?zāi)康挠胁煌牟僮鞑襟E，請根據(jù)試驗需要選擇下面介紹的操作步驟。

l  對于蛋白和轉(zhuǎn)錄檢測

注意：當在組織培養(yǎng)板中進行不同劑量的siRNA轉(zhuǎn)染時，轉(zhuǎn)染試劑和siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基的用量需要與不同孔的表面積成比率。

1，對每一次轉(zhuǎn)染，在一個無菌的小管里準備下面的混合物 這一步無關(guān)細胞培養(yǎng)類型

 （A） 加3.6ul 10uM的siRNA到40ul siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中，輕柔混合，在室溫中放置15分鐘 （注意：如果需要低濃度的siRNA，用siRNA稀釋緩沖液進行稀釋）

（B）加2.4ul siRNA轉(zhuǎn)染試劑到40ul的siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中，輕柔混合，室溫放置5分鐘。

注意：雖然siRNA轉(zhuǎn)染試劑對許多細胞都有很高的轉(zhuǎn)染效率，但并不是適用于所有的細胞

 2， 5分鐘后，混合A和B形成siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑混合物，輕柔混合，室溫孵育20分鐘。

 3， 然后，向每個含有siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑混合物的管中加入0.32ml的siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，輕柔混合