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上海金穗生物科技有限公司

質(zhì)體快速檢定法

時(shí)間：2012-9-7閱讀：646
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這個(gè)方法是以phenol 及chloroform 溶菌后直接進(jìn)?電泳分析，并未將質(zhì)體DNA與宿主細(xì)菌染色體DNA 分離，得到的DNA 也?能用限制酶作用。但因其快速簡(jiǎn)?，所以可藉的于短時(shí)間內(nèi)檢定大?轉(zhuǎn)形株中質(zhì)體DNA 的相對(duì)分子?，以初步篩選帶有重組質(zhì)體的轉(zhuǎn)形株。
 
藥品試劑：
LB/Amp plates （LB plate 添加100 μg/mL ampicillin）
1×NET （20 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 0.1 mM EDTA, pH 8.0）
PCI （25:24:1）
RNase A （1 mg/mL）
1% agarose gel
 
方法步驟：
1） 由前一天轉(zhuǎn)形所得的轉(zhuǎn)形株中，挑選12~24 個(gè)單一菌?，在LB/Amp plate上劃數(shù)道短的橫線或斜線，同時(shí)也須要接種帶有載體pQE31 的菌株，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜或直至菌體長(zhǎng)出。
2） 以接種環(huán)將菌體刮下，懸濁在30 μL 1×NET 中，震蕩混合均勻。
◆ ?要忘?pQE31/JM109！
3） 加入30 μL PCI，劇?震蕩。
4） 以12,000 rpm 離心3 min （室溫）。
5） 將上層液吸至另一支干凈離心管，加1 μL RNase A 及3 μL 10×追蹤染劑，以50 V 進(jìn)?電泳分析。 由于樣品中有細(xì)菌染色體DNA，所以在加入樣品槽時(shí)需十分小心，否則DNA 極??失在電泳緩沖液中。 電泳后，可由質(zhì)體DNA 的泳動(dòng)?知其相對(duì)分子?大小。　
6） 選取帶有質(zhì)體分子?大于pQE31 的菌?，接種于3 mL LB/Amp 液體培養(yǎng)基，于37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，以抽取質(zhì)體，進(jìn)?限制酶分析。

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