1.人NK 細(xì)胞克隆質(zhì)控與提示 
1.每天需檢查細(xì)胞生長情況。
2.NK 細(xì)胞克隆 只生長在96 孔板上，NK 細(xì)胞總是用96 孔培養(yǎng)板進(jìn)行克隆 培養(yǎng)。
3.目前了解，鼠NK 細(xì)胞克隆 的制備于短期培養(yǎng)。

2.試劑和材料
● 植物血凝素（PHA）母液為100μg/ml
● 重組IL－2（rIL－2）母液為105u/ml，分裝小瓶（0．5ml/瓶），置－20℃長期保存，或置4℃下短期存放。應(yīng)避免反復(fù)凍融，IL－2 不能用濾器過濾除菌處理。
● 培養(yǎng)基
1.接種培養(yǎng)液：RPMI1640＋10％FCS＋0．5μg/ml PHA＋200u/ml IL－2＋10g/L *＋100u/ml *＋100μg/ml *＋1mmol/L 丙酮酸鈉。
2.飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 液：RPMI1640＋10％FCS＋10g/L *＋100u/ml *＋100μg/ml*＋1mmol/L 丙酮酸鈉。
3.NK 克隆 培養(yǎng)液：RPMI1640＋10％FCS＋10g/L *＋100u/ml *＋100μg/ml *＋1mmol/L 丙酮酸鈉，經(jīng)0．2u 濾板過濾再加入100u/ml IL－2。
4.培養(yǎng)液：RPMI1640＋10％FCS。
● 飼養(yǎng)細(xì)胞：自體或同種異體PBMC
● 器皿和儀器：96 孔細(xì)胞培養(yǎng) 板、多頭移液管、微量移液管、倒置顯微鏡、CO₂ 孵箱、低溫離心機(jī)、垂直氣流超凈臺

3.實(shí)驗(yàn)操作
1.NK 細(xì)胞的制備
1） 制備NK 的方法參見*章之第四節(jié)。
2） 懸浮NK 于接種培養(yǎng)液中，細(xì)胞濃度調(diào)至106/ml。
2.接種NK 細(xì)胞
1） 制備飼養(yǎng)細(xì)胞（PBMC）方法參見*章*節(jié)。
2） 于4℃用300×g 離心飼養(yǎng)細(xì)胞12min。
3） 被離心的飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮于飼養(yǎng)培養(yǎng)液中，細(xì)胞濃度調(diào)至2×106/ml。
4） 用強(qiáng)度5000radγ射線照射飼養(yǎng)細(xì)胞，于4℃用300×g 離心飼養(yǎng)細(xì)胞12min，將離心細(xì)胞再懸浮于飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 液中，飼養(yǎng)細(xì)胞濃度調(diào)至2×10⁶ /ml。
5） 在6 塊96 孔培養(yǎng)板的各孔中加100μl 上述飼養(yǎng)細(xì)胞懸液（總量用60ml 飼養(yǎng)細(xì)胞懸液，含1．2×10⁸ 個(gè)飼養(yǎng)細(xì)胞）。
6） 將96 孔板置37℃孵箱預(yù)溫，直到加入NK 細(xì)胞。
7） 將NK 細(xì)胞懸浮于接種培養(yǎng)液中，并于預(yù)溫的96 孔板中加入100μlNK 細(xì)胞，使成為10 細(xì)胞/孔、5 細(xì)胞/孔和2．5 細(xì)胞/孔的三種類型板，而且每種類型重復(fù)二塊板。
8） 將培養(yǎng)板置5％CO₂ 孵箱中37℃培養(yǎng)。
3.NK 細(xì)胞的再刺激（接種后2－3 天，主要依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞）
1） 從每孔中輕輕移棄100μl 上清液。
2） 每孔中加入含有經(jīng)照射的飼養(yǎng)細(xì)胞（2×10⁶ 細(xì)胞/ml）的NK 克隆 培養(yǎng)液100μl。此培養(yǎng)液的制備方法如下：
（1） 融化飼養(yǎng)細(xì)胞，移至50ml 試管中。
（2） 輕輕地加入培養(yǎng)液30ml，混勻后用5000radγ射線照射飼養(yǎng)細(xì)胞。
（3） 用300×g 離心飼養(yǎng)細(xì)胞12min，并計(jì)數(shù)飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量。
（4） 按細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，將飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮于NK 克隆 培養(yǎng)液中，調(diào)至細(xì)胞濃度為2×10⁶ /ml。
4.換液（6－8 天）從每孔中輕輕移棄100μl 上清液，并加入新鮮NK 克隆 培養(yǎng)液100μl。
5.檢測NK 細(xì)胞的生長狀況（9－10 天）如檢查有細(xì)胞生長，按第8 天的操作換液。
6.分離克隆 （11－15 天）
1） 當(dāng)培養(yǎng)液顏色變黃時(shí)，證明細(xì)胞已生長，在96 孔板上將生長的NK 按1 孔分為2 孔，2 孔分為4 孔，4 孔分為8 孔的方式分離克隆 培養(yǎng)。
2） 在96 孔板上擴(kuò)增克隆 ，并重復(fù)第7 天的操作。

4.基本原理
NK 細(xì)胞克隆 來源于NK 細(xì)胞，該細(xì)胞的分離方法參見*節(jié)之四。這些NK 細(xì)胞與經(jīng)γ射線照射的飼養(yǎng)細(xì)胞苓而獲得的NK 細(xì)胞克隆 。