試劑及器材

1．試劑

蛋白酶K：稱取20mg蛋白酶K溶于1ml消毒雙蒸水中，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

RNase（牛胰）：稱取10mgRNase溶于1ml下列混合液中：10mmol/l Tris-HCl，pH8.0； 1mmol/L EDTANa2 pH8.0；

10％SDS溶液：稱取10gSDS溶于100ml消毒雙蒸水中，于65℃保溫2小時(shí)，貯存室溫備用。

1×TE緩沖液（pH8.0）：10mmol/L Tris-HCl pH8.0；1mmol/LEDTANa2 pH8.0。配制后高壓滅菌，4℃貯存。

1×TE飽和重蒸酚（pH8.0）

氯仿/異戊醇（24:1V/V）

10mol/LNH4AC，配制后高壓滅菌，4℃貯存

無水乙醇（AR）

70%乙醇

2．器材

玻璃勻漿器；離心機(jī)；電泳儀；電泳槽；紫外透射反射分析儀

實(shí)驗(yàn)操作

1．組織DNA的提取

① 取小鼠新鮮肝組織，去除結(jié)締組織，用剪刀剪成細(xì)小碎塊

② 加10倍體積TE緩沖液，用玻璃勻漿器在冰浴中中速勻漿；將勻漿液轉(zhuǎn)入10ml離心管以4000rpm離心10分鐘，棄上清；加10倍體積TE洗一遍，以4000rpm離心10分鐘，棄上清

③ 加適量TE稀釋

④ 取400μl稀釋液于1.5ml的Eppendorf管，緩慢加入10％SDS溶液，至終濃度0.5％  （加20μl），搖勻直至溶液變粘稠

⑤ 加入Rnase（200μg/ml）至終濃度20ug/ml（42μl）混勻，置37℃保溫60分鐘（總體積 420μl）。

⑥ 加蛋白酶K（20mg/ml）至終濃度100ug/m1混勻（加21ul），于50℃保溫3小時(shí)，并間歇攪動（總體積441μl）。

⑦ 將此溶液冷卻至室溫，加等體積飽和酚抽提，以10000rpm離心10分鐘；取上清加1/2體積飽和酚，1/2體積氯仿/異戊醇抽提一次，以10000rpm離心10分鐘；取上清，加等體積氯仿/異戊醇抽提一次，以10000rpm離心10分鐘；加1/10體積5MKAc，加2倍體積無水乙醇充分混勻，以12000rpm離心10分鐘

⑧ 加lml70％乙醇洗沉淀，以12000rpm離心10分鐘

⑨ 待酒精揮發(fā)盡后加20ul TE溶解，4℃儲存

2．電泳鑒定

取DNA樣品2μl加上樣緩沖液10μl ，在0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行水平微型電泳，電壓<5V/cm，時(shí)間2小時(shí)左右。電泳后取出凝膠，用0.5μg/ml的溴化乙錠染色20分鐘，用紫外燈觀察分析。

DNA以核蛋白形式存在于細(xì)胞核中，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。蛋白酶K及*E的應(yīng)用使這兩個原則得到了保證。

蛋白酶K或*E均為廣譜蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應(yīng)體系中，SDS可破壞細(xì)咆膜、核膜，并使組織蛋白與 DNA分子分離，EDTA抑制細(xì)胞中DNase活性，蛋白酶K或*E將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。再用酚、酚／氯仿抽提除去蛋白質(zhì)，接著用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染。zui后用無水乙醇沉淀DNA。為獲得高純度DNA，操作過程中常加入RNase除去RNA。獲得高分子量DNA的關(guān)鍵是防止DNase降解DNA。故標(biāo)本必須新鮮，在提取前細(xì)胞就保持完整，核、溶酶體等細(xì)胞器應(yīng)沒有明顯破壞，提取DNA用的離心管等器皿及試劑應(yīng)消毒。操作在4℃以下進(jìn)行。